Blog

Jun 20, 2024

La agregación de Pseudomonas aeruginosa y la expresión de Psl en el esputo se asocian con el fracaso de la erradicación de antibióticos en niños con fibrosis quística

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 21444 (2022) Cita este artículo 1165 Accesos 3 Citas 2 Detalles de métricas altmétricas Anteriormente demostramos que los aislados de P. aeruginosa que persistieron

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 21444 (2022) Citar este artículo

1165 Accesos

3 citas

2 altmétrico

Detalles de métricas

Anteriormente demostramos que los aislados de P. aeruginosa que persistieron en niños con fibrosis quística (FQ) a pesar del tratamiento con tobramicina inhalada tenían una mayor unión de anticuerpos anti-Psl in vitro en comparación con los que se erradicaron con éxito. Nuestro objetivo fue validar estos hallazgos visualizando directamente P. aeruginosa en el esputo de la FQ. Este fue un estudio observacional prospectivo de niños con FQ con infección de nueva aparición por P. aeruginosa que se sometieron a un tratamiento de erradicación con tobramicina inhalada. Utilizando la técnica de claridad pasiva de identificación microbiana (MiPACT), se visualizó P. aeruginosa en muestras de esputo obtenidas antes del tratamiento y se clasificó como persistente o erradicada según los resultados. Los aislados previos al tratamiento también se cultivaron como biopelículas in vitro. De 11 pacientes inscritos, 4 desarrollaron infección persistente y 7 erradicaron la infección. El biovolumen de P. aeruginosa y el número y tamaño de los agregados de P. aeruginosa fueron mayores en el esputo de aquellos con infecciones persistentes en comparación con las erradicadas (p <0,01). La cantidad de unión del anticuerpo Psl en el esputo también fue mayor en general (p <0,05) en las muestras con mayor biovolumen de P. aeruginosa. Cuando se visualiza en el esputo, P. aeruginosa tenía un biovolumen mayor, con Psl más expresado, y formó agregados más numerosos y más grandes en los niños con FQ que fracasaron en la terapia de erradicación en comparación con aquellos que eliminaron con éxito su infección.

Las personas con fibrosis quística (FQ) son susceptibles a la infección pulmonar por Pseudomonas aeruginosa debido a defectos en el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) que provocan una alteración del aclaramiento mucociliar1. Sin tratamiento antimicrobiano, P. aeruginosa puede establecer una infección crónica en las vías respiratorias que se asocia con una disminución más rápida de la función pulmonar y una muerte prematura en pacientes con FQ2,3. Por lo tanto, el tratamiento temprano de erradicación antibiótica (AET) de la colonización inicial por P. aeruginosa es la atención clínica estándar de los niños con FQ y aumentar la tasa de éxito de la AET es clave para mejorar los resultados a largo plazo4,5.

Existen pocas explicaciones de por qué la AET puede fallar en un paciente con FQ. Anteriormente demostramos, utilizando un modelo de biopelícula visualizado por microscopía confocal, que los aislados iniciales de P. aeruginosa de niños que fallaron en la AET tenían una unión de anticuerpos anti-Psl significativamente mayor en comparación con los aislados de aquellos que eliminaron P. aeruginosa6. El aumento de la unión del anticuerpo anti-Psl se asoció con la agregación bacteriana y la tolerancia a la tobramicina. Psl es un exopolisacárido (EPS) de P. aeruginosa que ha sido bien descrito por su papel en la adhesión de unión entre células y sustrato celular y en la formación de biopelículas in vitro7,8,9,10,11,12. Aunque nuestros hallazgos se confirmaron en colecciones separadas de aislados clínicos tempranos de P. aeruginosa de dos ensayos AET distintos, estos resultados se basaron en estudios in vitro de P. aeruginosa en un sistema de cámara de portaobjetos de vidrio.

A pesar del uso de aislados clínicos y condiciones de crecimiento bacteriano que imitan las vías respiratorias de la FQ, los modelos de laboratorio que examinan el comportamiento de los patógenos de la FQ y los efectos de los antibióticos pueden no reflejar con precisión las condiciones de las vías respiratorias de los pacientes13. Las decisiones sobre los tiempos de incubación, los medios de crecimiento y las concentraciones de antimicrobianos, por ejemplo, pueden alterar significativamente los resultados experimentales y es muy difícil captar plenamente las complejidades del entorno pulmonar de la FQ. Con estos desafíos, tal vez no sea sorprendente que exista una desconexión entre los resultados de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos y los resultados clínicos en la FQ14.

Sin embargo, los avances recientes en el procesamiento y la obtención de imágenes de muestras del tracto respiratorio han permitido la visualización directa y la interacción de especies microbianas en muestras de pacientes. La técnica de claridad pasiva de identificación microbiana (MiPACT), desarrollada por DePas et al., fija y visualiza bacterias mediante reacción en cadena de hibridación para detectar ARNr en esputo de FQ15. Estas metodologías obvian la necesidad de hacer inferencias al traducir resultados in vitro a in vivo. El objetivo de este estudio fue validar nuestros hallazgos previos sobre una mayor unión de anticuerpos anti-Psl y agregación bacteriana en aislados persistentes de P. aeruginosa mediante la visualización directa de biopelículas de P. aeruginosa en el esputo en un ensayo observacional prospectivo de niños con FQ sometidos a AET. También intentamos determinar si, de hecho, podríamos replicar los resultados in situ de muestras clínicas utilizando nuestro modelo de cámara de portaobjetos de biopelícula in vitro.

Las características de los pacientes inscritos se presentan en la Tabla 1. Un total de 11 pacientes con FQ con infección por P. aeruginosa de nueva aparición produjeron una muestra de esputo antes del inicio del tratamiento y fueron incluidos en el estudio; 7 erradicaron exitosamente P. aeruginosa después de 1 mes de tobramicina inhalada (sin cultivo de esputo positivo para P. aeruginosa durante al menos 6 meses después del cultivo positivo inicial), mientras que 4 desarrollaron infección persistente a pesar del tratamiento (cultivo de esputo positivo para P. aeruginosa en los 6 meses posteriores). el cultivo positivo inicial) (ver Métodos). De los 4 que desarrollaron una infección persistente, 3 tenían aislamientos de P. aeruginosa de seguimiento disponibles para la secuenciación del genoma completo que demostraban la persistencia de la misma cepa (menos de 10 polimorfismos de un solo nucleótido de diferencia entre la cepa inicial y la de seguimiento). No hubo diferencias significativas entre los dos grupos en términos de datos demográficos como edad, sexo, función pulmonar inicial, estado nutricional o proporción de pacientes en tratamiento con modulador de CFTR. Es de destacar que no hubo diferencias significativas en la proporción de pacientes con un aislado mucoide inicial de P. aeruginosa que erradicaron en comparación con los que desarrollaron una infección persistente.

Se obtuvo una muestra de esputo de cada paciente inscrito antes de iniciar el tratamiento con tobramicina inhalada, y se marcó P. aeruginosa mediante hibridación fluorescente in situ (FISH) y se visualizó mediante microscopía confocal. Hubo un aumento del biovolumen de P. aeruginosa (por corte de esputo), así como un mayor número de agregados de P. aeruginosa más grandes en el esputo de niños con FQ que posteriormente fracasaron en la terapia de erradicación en comparación con aquellos que eliminaron con éxito la infección (Fig. 1). En la Fig. 2 se muestran imágenes representativas. La cantidad de P. aeruginosa en cada muestra de esputo también se cuantificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR); Las concentraciones de P. aeruginosa medidas por qPCR no se correlacionaron con el biovolumen de P. aeruginosa visualizado directamente en muestras de esputo fijadas (Figura 1 complementaria). De manera similar, no hubo correlación entre el biovolumen de esputo de P. aeruginosa y las medidas semicuantitativas del crecimiento de P. aeruginosa en placas de la muestra de esputo original en el laboratorio de microbiología clínica (datos no mostrados).

Los pacientes con infección persistente tuvieron mayor biovolumen de P. aeruginosa y mayor número de agregados de mayor tamaño en comparación con aquellos con infección erradicada. Visualización de P. aeruginosa en la muestra de esputo inicial de controles negativos (PA negativo, n = 3), controles positivos (PA crónico, n = 3), niños con FQ que erradicaron la infección (erradicados, n = 7) y niños con FQ que desarrollaron una infección persistente (Persistente, n = 4). Mediana representada (línea horizontal) P. aeruginosa (A) intensidad promedio del biovolumen (μm3)/corte de esputo, (B) número promedio de agregados/corte de esputo, (C) tamaño promedio máximo de agregado (μm)/corte de esputo. **p < 0,01 utilizando la prueba de Mann-Whitney.

Imágenes confocales 3D representativas de P. aeruginosa en el esputo de pacientes con FQ que muestran agregados más numerosos y más grandes en aquellos con infección persistente en comparación con los erradicados. Las diferencias estructurales de P. aeruginosa se muestran utilizando una sonda molecular marcada con fluorescencia específica para P. aeruginosa (verde), mAb anti-Psl (magenta), sondas moleculares de tinción de ácido nucleico DAPI (azul) e imagen fusionada, con lente objetivo de aceite ×100. .

También se visualizó Pseudomonas aeruginosa Psl dentro del esputo utilizando un anticuerpo anti-Psl marcado con fluorescencia. La Figura 3A muestra que la cantidad de unión del anticuerpo Psl en el esputo fue mayor en aquellos que desarrollaron una infección persistente en comparación con aquellos que erradicaron la infección. Sin embargo, una vez corregido por el aumento del biovolumen de P. aeruginosa, la unión del anticuerpo Psl por 100.000 µm3 de biovolumen de P. aeruginosa fue ligeramente mayor en el grupo erradicado en comparación con el grupo persistente (p = 0,04, Fig. 3B). La proporción de anticuerpo anti-Psl colocalizado con P. aeruginosa (representado por el coeficiente M2) fue similar tanto en el grupo erradicado como en el persistente (Fig. 3C). La Figura 3D muestra imágenes representativas de cada categoría de muestra de esputo.

Mayor tinción general de anticuerpos anti-Psl de P. aeruginosa en el esputo de pacientes con infección persistente en comparación con la erradicada. Muestra de esputo inicial de controles negativos (PA negativa, n = 3), controles positivos (PA crónica, n = 3), niños con FQ para quienes se erradicó la infección (Erradicada, n = 7) y niños con FQ que desarrollaron infección persistente ( Persistente, n = 4). La línea horizontal indica la mediana. (A) intensidad de unión promedio del anticuerpo anti-Psl (μm3)/corte de esputo, (B) unión promedio del anticuerpo Psl por 100.000 µm3 de biovolumen de P. aeruginosa/corte de esputo, (C) proporción promedio de anticuerpo anti-Psl co-localizado con P . aeruginosa representada por el coeficiente M2, (D) imágenes representativas del esputo de un paciente con infección persistente, erradicada y crónica, verde: P. aeruginosa, magenta: anticuerpo anti-Psl, blanco: anticuerpo Psl co-localizado con P. aeruginosa . *p < 0,05, ns: no significativo mediante la prueba de Mann-Whitney.

Para determinar si estas características de P. aeruginosa observadas en niños con FQ podrían replicarse in vitro, luego cultivamos los aislados iniciales de P. aeruginosa obtenidos de estos pacientes durante 48 h como biopelículas en nuestro modelo de cámara de portaobjetos de vidrio. Al igual que con P. aeruginosa visualizada en el esputo, la unión del anticuerpo Psl (por pocillo) fue mayor en los aislados de niños que desarrollaron una infección persistente en comparación con los aislados de aquellos que erradicaron la infección (Fig. 4A). Sin embargo, una vez corregido para el biovolumen de P. aeruginosa, la unión del anticuerpo Psl por 100.000 µm3 de biovolumen de P. aeruginosa no fue diferente entre los aislados persistentes y erradicados (Fig. 4B). Aunque la mediana del biovolumen de P. aeruginosa en las cámaras de portaobjetos después de 48 h de crecimiento fue mayor para los aislados persistentes en comparación con los erradicados, esta diferencia no fue estadísticamente significativa (Fig. 4C).

Mayor tinción general de anticuerpos anti-Psl en la cámara de portaobjetos de vidrio de aislados de P. aeruginosa de pacientes con infección persistente en comparación con infección erradicada. Aislados de P. aeruginosa erradicados (n = 7) y persistentes (n = 4) cultivados durante 48 h como biopelículas en una cámara de portaobjetos de vidrio y luego marcados con anticuerpo anti-Psl fluorescente durante 3 h y luego visualizados con microscopía confocal. Línea horizontal, mediana. (A) intensidad de unión promedio del anticuerpo anti-Psl (μm3)/pozo, (B) unión promedio del anticuerpo Psl por 100.000 m3 de biovolumen de P. aeruginosa/pozo, (C) intensidad promedio del biovolumen de P. aeruginosa (μm3)/pocillo. *p < 0,05, ns: no significativo mediante la prueba de Mann-Whitney.

Dado que los aislados persistentes no pudieron eliminarse con la terapia con tobramicina en nuestros pacientes, nuestro objetivo fue determinar si esta tolerancia a la tobramicina podría medirse en nuestro modelo in vitro. Los aislamientos iniciales de P. aeruginosa de pacientes que posteriormente desarrollaron una infección persistente (aislados persistentes) o erradicados (aislados erradicados) se cultivaron durante 24 h como biopelículas en cámaras de portaobjetos de vidrio y luego se expusieron a dosis altas (1000 µg/ml) de tobramicina durante 24 h. . La tobramicina redujo significativamente el biovolumen de los aislados erradicados pero no de los aislados persistentes (Fig. 5A). Para replicar el entorno pulmonar de FQ, los aislados también se cultivaron en presencia de un sobrenadante de esputo de FQ combinado al 5% y luego se trataron con tobramicina; nuevamente, el biovolumen de los aislados erradicados se redujo significativamente y hubo una tendencia no significativa (p = 0,05) a una reducción significativa en los aislados persistentes (Fig. 5A). La actividad metabólica de los aislados también se midió mediante un ensayo de ATP y demostró una reducción significativa con el tratamiento con tobramicina para los aislados erradicados y persistentes en ambas condiciones de crecimiento (Fig. 5B). El grado de agregación bacteriana (medido por la relación superficie-biovolumen) no fue diferente para los aislados erradicados y persistentes (Fig. 5C).

Diferencias en la respuesta y agregación de tobramicina entre aislamientos de P. aeruginosa persistentes y erradicados en una cámara de portaobjetos de vidrio. Aislados de P. aeruginosa erradicados (n = 7) y persistentes (n = 4) cultivados durante 24 h como biopelículas en una cámara de portaobjetos de vidrio y luego tratados con 1000 µg/ml de tobramicina durante 24 h adicionales y luego visualizados con microscopía confocal. LB: Caldo de Lisogenia solo; + T: más Tobramicina; SS: en presencia de sobrenadante de esputo de CF combinado al 5 %. Línea horizontal, mediana. (A) intensidad media del biovolumen de P. aeruginosa (μm3)/pozo, (B) luminiscencia media en unidades de luz relativas (RLU) del ensayo de ATP/pozo, (C) grado medio de agregación medido por la relación superficie-biovolumen/pozo. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ns: no significativo mediante la prueba de Mann-Whitney.

Hasta donde sabemos, este estudio es el primero en demostrar que los niños con FQ que no logran erradicar la infección de nueva aparición por P. aeruginosa con terapia con tobramicina están infectados con agregados más numerosos y grandes de P. aeruginosa que expresan un aumento de Psl debido al mayor biovolumen de P. aeruginosa. In vitro, también se observó un aumento de la unión del anticuerpo anti-Psl en los aislamientos persistentes en comparación con los erradicados, pero una vez corregida por el biovolumen, esta diferencia no fue significativa; La resistencia a la tobramicina y una mayor agregación bacteriana no se observaron consistentemente en los aislados persistentes en nuestro modelo de cámara de portaobjetos de vidrio, lo que resalta la importancia de la observación directa in vivo de las infecciones pulmonares por P. aeruginosa en pacientes con FQ.

Estudios anteriores, incluido el nuestro, han intentado identificar las características de P. aeruginosa asociadas con el fracaso de la AET en la FQ. Anteriormente se ha demostrado que los fenotipos asociados con la infección crónica, como el estado de mucoidía y los fenotipos arrugados típicos de los productores de biopelículas, tienen una asociación débil con el fracaso de la AET16,17. Sorprendentemente, una mayor cantidad de P. aeruginosa, medida mediante recuentos de densidad bacteriana del esputo, por ejemplo, no se ha identificado como un factor de riesgo para el fracaso del tratamiento de erradicación con tobramicina inhalada. El laboratorio de microbiología clínica no realiza de forma rutinaria mediciones de la densidad bacteriana del esputo en caso de infecciones incidentes inesperadas y, lo que es más importante, se basan en el crecimiento planctónico de muestras de esputo homogeneizadas, diluidas en serie y en placas. El aumento del biovolumen de P. aeruginosa identificado en nuestros pacientes que desarrollaron una infección persistente solo se observó en la visualización directa de sus muestras de esputo fijadas y embebidas. El biovolumen de esputo de P. aeruginosa no se correlacionó ni con las medidas semicuantitativas de crecimiento en placas ni con las concentraciones de P. aeruginosa medidas en el esputo mediante PCR.

A través de la visualización directa de P. aeruginosa dentro del esputo, también pudimos observar agregados más numerosos y más grandes en aquellos en los que no se logró la AET. La agregación bacteriana es un mecanismo bien reconocido de tolerancia a los antibióticos y evasión inmunitaria18. Hay muchos factores que contribuyen a la agregación de P. aeruginosa en las vías respiratorias de la FQ. Las características bacterianas intrínsecas incluyen la expresión de Psl. Nuestros colaboradores han demostrado previamente que los agregados de P. aeruginosa en el esputo de la FQ expresan Psl y que dicha agregación probablemente se produce a través de un mecanismo de puente de polímero mediado por EPS19. Observamos una mayor unión de anticuerpos anti-Psl tanto in vivo (en el esputo del paciente) como in vitro (aislados cultivados en el modelo de cámara de portaobjetos de vidrio) para pacientes con FQ con infección persistente en comparación con la erradicada. Sin embargo, a diferencia de nuestra publicación anterior, una vez ajustada por 100.000 µm3 de biovolumen de P. aeruginosa, esta diferencia ya no fue significativa, lo que sugiere que los aislados persistentes no tienen una mayor expresión de Psl por célula, sino que había más células bacterianas, cada una de las cuales expresaba la misma cantidad de Psl, en aislamientos persistentes que en erradicados6. Además de las características específicas de P. aeruginosa, existen factores extrínsecos, condiciones en las vías respiratorias de la FQ, que promueven la agregación bacteriana. Por ejemplo, Singh et al. demostraron que la elastasa de neutrófilos secretada en el sobrenadante de esputo puede escindir los flagelos de P. aeruginosa, disminuyendo la motilidad y desencadenando la agregación20. Es de destacar que esta agregación puede ocurrir a pesar de mutaciones en genes relacionados con biopelículas, lo que subraya la diferencia entre agregación y formación de biopelículas. La composición del esputo en sí también puede afectar la agregación, ya que se ha demostrado que la mucina mejora la agregación, al igual que la presencia de polímeros del huésped, a través de un mecanismo de agotamiento21,22. A pesar de cultivar nuestros aislados persistentes in vitro en un sobrenadante de esputo de FQ combinado (que comprende productos celulares excretados pero sin células huésped ni otras células bacterianas), no pudimos replicar el aumento de agregación observado en el esputo de pacientes que desarrollaron una infección persistente. De manera similar, la exposición de los aislados erradicados y persistentes a la tobramicina provocó una disminución de la actividad metabólica, lo que puede representar una respuesta protectora bacteriana23. El análisis directo de la composición del esputo de nuestros pacientes incluidos estuvo más allá del alcance de este estudio; sin embargo, se justifican investigaciones futuras en esta área.

Este estudio utilizó MiPACT para visualizar directamente las comunidades bacterianas en las vías respiratorias24. Otros investigadores han utilizado estos métodos para describir la composición de las infecciones de las vías respiratorias en pacientes con FQ, con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y con neumonía asociada a ventilación mecánica (NAV)15,25. Sin embargo, el estudio actual es el primero en utilizar MiPACT para identificar diferencias en las características bacterianas que se correlacionan con la respuesta a la terapia con antibióticos. Esto es de particular importancia para los pacientes con FQ, ya que hasta la fecha no se ha desarrollado ninguna prueba que pueda predecir los resultados clínicos del tratamiento con antibióticos14. Las complejidades del entorno pulmonar de la FQ, con sus condiciones de crecimiento únicas, interacciones polimicrobianas y desafíos en la administración de fármacos, son muy difíciles, si no imposibles, de replicar en el laboratorio13. Incluso en nuestro modelo de cámara de portaobjetos de vidrio basado en el crecimiento de biopelículas e incorporando factores del huésped en forma de sobrenadante de esputo de FQ, no pudimos demostrar consistentemente la tolerancia a la tobramicina y la agregación bacteriana mediante aislados persistentes in vitro. Nuestros estudios in vitro anteriores que demostraron tolerancia a la tobramicina y una mayor agregación en aislados persistentes de P. aeruginosa solo lo hicieron con la adición de filtrado de Staphylococcus aureus, SpA o anticuerpo anti-Psl, cuya relevancia clínica no está clara6,26. El uso de la metodología MiPACT para visualizar otras especies bacterianas y células inmunes del huésped, así como su interacción geoespacial, tiene el potencial de mejorar nuestra comprensión de las infecciones por FQ más complicadas, como las asociadas con exacerbaciones pulmonares15,27.

Hubo varias limitaciones para este estudio. El tamaño de la muestra de pacientes fue pequeño e incluyó solo pacientes mayores que podían producir esputo, lo que limitó la generalización de los hallazgos a niños con FQ con infección por P. aeruginosa de nueva aparición detectada a partir de hisopos de garganta. Además, la obtención de muestras de esputo se ha vuelto más difícil con la introducción de la terapia moduladora del CFTR, lo que reduce la capacidad de expectoración de los pacientes con FQ28. Sin embargo, a pesar del pequeño número de pacientes inscritos, se demostraron diferencias estadísticamente significativas en la formación de agregados de P. aeruginosa en el esputo entre los grupos de pacientes. Además, debido al menor volumen de esputo producido por los niños, no había suficiente muestra para realizar diluciones seriadas para calcular la densidad bacteriana del esputo [en unidades formadoras de colonias (UFC)/ml]. Sin embargo, las medidas semicuantitativas de la carga de P. aeruginosa identificadas mediante placas de la muestra de esputo original en el laboratorio de microbiología clínica estaban disponibles para comparación. Finalmente, este estudio se centró únicamente en las características de P. aeruginosa asociadas con el fracaso de la AET, pero es probable que existan otros factores, como las interacciones con otros organismos y las respuestas del huésped, que desempeñan un papel26. Otros investigadores han demostrado que los leucocitos polimorfonucleares responden agresivamente hacia una matriz de biopelícula que consiste tanto en exopolisacáridos de Psl como de alginato, respuestas que no se consideran en nuestro estudio actual29.

En conclusión, este estudio demostró que los niños con FQ que no lograron erradicar la infección respiratoria por P. aeruginosa con tobramicina inhalada estaban infectados con P. aeruginosa que expresa Psl y que forma agregados más numerosos y más grandes que aquellos que lograron eliminar su infección. Estos grupos de pacientes no se pudieron distinguir de manera confiable utilizando métodos in vitro estándar, lo que destaca la necesidad de visualizaciones directas de las infecciones dentro de las vías respiratorias para predecir la respuesta a los antibióticos en la FQ.

Este fue un estudio observacional prospectivo realizado en SickKids (Toronto, Canadá) entre marzo de 2020 y 2022. Se inscribieron niños con FQ si tenían una nueva infección por P. aeruginosa definida como un cultivo de esputo positivo para P. aeruginosa con al menos 3 cultivos negativos anteriores en los 12 meses anteriores16,30. Después de la inscripción, se obtuvo un cultivo de esputo antes de comenzar con la tobramicina inhalada durante 28 días. Según el protocolo AET de SickKids, si el cultivo de esputo obtenido 1 semana después de finalizar el tratamiento con tobramicina inhalada todavía era positivo para P. aeruginosa, se prescribieron 28 días adicionales de tobramicina inhalada; si el cultivo de esputo seguía siendo positivo para P. aeruginosa después de la segunda ronda de tobramicina inhalada, el paciente era ingresado en el hospital y se le recetaba tobramicina y ceftazidima intravenosas durante 2 semanas, seguidas de 28 días adicionales de tobramicina inhalada31.

El fracaso de la AET se definió como un cultivo de esputo positivo para P. aeruginosa en los 6 meses posteriores al cultivo positivo inicial; Todos los pacientes inscritos tuvieron un mínimo de 6 meses de seguimiento en el estudio. Si un paciente no tuvo éxito en la AET, el aislado inicial de P. aeruginosa (obtenido antes de comenzar con la tobramicina inhalada) se definió como persistente; de lo contrario, el aislamiento inicial se definió como erradicado.

Se incluyeron controles de esputo negativos para P. aeruginosa mediante qPCR de niños con FQ que nunca habían cultivado P. aeruginosa en su tracto respiratorio. Se incluyeron controles de esputo positivos para P. aeruginosa mediante qPCR de niños con FQ con infección crónica por P. aeruginosa32. La extracción de ADN y la qPCR se realizaron como se describió anteriormente30.

El procesamiento del esputo se realizó mediante una técnica adaptada MiPACT (limpieza de tejidos), descrita anteriormente15,24. En resumen, se recogieron muestras de esputo expectorado de los pacientes inscritos en un recipiente estéril y se almacenaron inmediatamente a 4 °C. Dentro de las 24 h posteriores a la recolección, se fijaron tapones de esputo (aproximadamente 0,2 g) en paraformaldehído (PFA) al 4 %, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x y luego se seccionaron en rodajas pequeñas (de aproximadamente 5 mm de diámetro). Se agregaron rodajas de esputo individuales a pocillos separados de un cubreobjetos de ocho cámaras Nunc™ Lab-Tek™ (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON), que constaba de 250 µl de una mezcla de hidrogel. La mezcla de esputo-hidrogel (dentro de los pocillos de la cámara) se selló dentro de un recipiente BD GasPak™ EZ (VWR, Mississauga, ON) con un paquete anaeróbico y luego se dejó polimerizar durante 3 h, a 37 °C. Después de la polimerización, la muestra solidificada se aclaró en una solución de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 8% (ajustada a pH 8) durante 3 a 5 días, a 37 °C. Después de la eliminación, los hidrogeles de esputo se lavaron con 1X PBS y se almacenaron en una solución de azida sódica al 0,01 % (p/vol), a 4 °C hasta la obtención de imágenes.

Para visualizar P. aeruginosa y el exopolisacárido, Psl, dentro de los hidrogeles de esputo, se realizó una técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH), como se describió anteriormente24 con ajustes menores. En resumen, los hidrogeles de esputo se seccionaron en tres rodajas finas (aproximadamente 1 mm de espesor cada una) y luego se agregaron a 500 µl de tampón de hibridación con 4 µl de sonda PsearA-Alexa488 (verde) 100 µM. Se permitió que la sonda PsearA, dirigida al fragmento del gen 16S rRNA de P. aeruginosa, se incubara con los hidrogeles de esputo durante 18 a 24 h, a 46 °C. Los hidrogeles de esputo se enjuagaron en un tampón de lavado y luego se incubaron en 1 ml de tampón de lavado nuevo durante 6 h, a 48 °C. Después de la hibridación de la sonda de ADN, los hidrogeles de esputo se lavaron con 1 × PBS y se incubaron en una solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 2% durante 18 a 24 h, en la oscuridad, a temperatura ambiente. Al día siguiente, se retiraron los hidrogeles de esputo y se agregaron a 500 µl de solución fresca de BSA al 2 % con 4 µl de 2 mg/ml de anticuerpo anti-Psl Psl0096-Alexa594 (rojo), luego se incubaron durante 6 h, en la oscuridad, a temperatura ambiente. . Los hidrogeles de esputo se lavaron con 1 × PBS y luego se incubaron en 250 µl de solución de adaptación del índice de refracción (RIMS) con 4 µl de DAPI de 10 µg/ml, en la oscuridad, a temperatura ambiente con rotación suave. Las rodajas de hidrogel de esputo se montaron en un portaobjetos de microscopio y se sellaron con una cámara de perfusión CoverWell™ de 1,7 mm (Sigma-Aldrich, Oakville, ON).

Las imágenes utilizadas para el análisis se adquirieron utilizando un microscopio confocal de disco giratorio Quorum Wave FX Borealis, basado en un cabezal de escaneo Yokohama CSU-10. El anticuerpo Psl0096 marcado fluorescentemente (rojo), la sonda PsearA P. aeruginosa (verde) y la tinción de ácido nucleico DAPI (azul) se excitaron utilizando líneas de excitación de 561, 491 y 405 nm, respectivamente. Los hidrogeles de esputo se visualizaron con una lente Zeiss de 20 ×/0,75, acoplada a un acoplador de aumento de 1,6 ×. La adquisición de imágenes se realizó utilizando el software Quorum Volocity 6.3. Se adquirieron un total de 6 imágenes de pila z por diapositiva en incrementos de 0,3 µm. Todo el procesamiento de imágenes de hidrogel z-stack se realizó utilizando Volocity. La colonización por P. aeruginosa dentro del esputo se cuantificó utilizando la intensidad del biovolumen, el tamaño máximo del objeto (la medida mínima considerada como un agregado establecido en 2 µm3) y las funciones de número de población. La unión del anticuerpo Psl dentro de las biopelículas de P. aeruginosa se calculó utilizando la relación de vóxeles total del canal rojo a verde. Por último, se seleccionó el coeficiente de Manders (M2) para calcular el grado de colocalización de Psl a PA. Todas las imágenes se incluyen en los materiales complementarios como figura complementaria 2.

Se adquirieron imágenes representativas tridimensionales a 100 × inmersión en aceite utilizando un microscopio STED confocal Leica SP8 Lightning. La sonda PsearA P. aeruginosa (verde), el anticuerpo Psl0096 (magenta) y la tinción de ácido nucleico DAPI (azul) se excitaron utilizando líneas de excitación de 592, 488 y 405 nm, respectivamente. Los hidrogeles de esputo se visualizaron con una lente de aceite de 100 ×/1,4 (STED). La adquisición y el procesamiento de imágenes se realizaron utilizando el software Leica LAS, Lightning Module, Navigator. Se capturaron imágenes representativas de pila en z de aislamientos de P. aeruginosa erradicados y persistentes en incrementos de 0,25 µm.

Una porción del esputo recolectado de los pacientes del estudio se utilizó para la recuperación del aislado de P. aeruginosa. Las muestras de esputo se esparcieron en placas de agar MacConkey (con cristal violeta al 8%) y luego se incubaron durante 48 h a 42 °C. Luego se cultivaron morfotipos individuales en agar sangre durante 24 h adicionales a 37 °C. La identificación de P. aeruginosa se confirmó mediante desorción/ionización asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-ToF) y los aislados se congelaron a -80 °C hasta el examen posterior mediante un modelo de cámara de portaobjetos de vidrio y un ensayo de ATP. Si el aislado no se pudo recuperar de la muestra de esputo obtenida para MiPACT, el aislado inicial de P. aeruginosa identificado por el laboratorio de microbiología clínica en la muestra de esputo inicial del paciente se recuperó para los siguientes experimentos.

Los aislados de Pseudomonas aeruginosa recuperados de las muestras de esputo se cultivaron como biopelículas usando un cubreobjetos de vidrio de 8 cámaras Nunc Lab-Tek II (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON), descrito previamente33. En resumen, P. aeruginosa se cultivó en LB (óptimo para cultivar biopelículas en la cámara de portaobjetos de vidrio) durante 24 h a 37 °C con agitación (225 rpm). El cultivo se diluyó 1:100 y luego se cultivó hasta una fase logarítmica temprana de 0,1 DO a 600 nm. De este cultivo, se agregaron 200 µL a los pocillos de una cámara de portaobjetos de vidrio y luego se incubaron durante 24 h a 37 °C. Al día siguiente, se eliminó el medio y se agregaron 200 µl de LB solo o LB con tobramicina (concentración final 1000 µg/ml) a los pocillos designados y luego se incubaron durante 24 h a 37 °C. Después de la incubación, se eliminó el medio y se agregaron a los pocillos 200 µl de tinción fluorescente de células vivas Syto-9™ en LB, luego se incubaron durante 45 minutos. Los pocillos se lavaron 2 veces con LB y se volvió a agregar LB a los pocillos antes de la visualización mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM). Este procedimiento también se replicó en presencia de un 5% de sobrenadante de esputo de FQ combinado, según un protocolo previo modificado34,35; sobrenadante de esputo compuesto de productos celulares excretados pero no de células huésped o bacterianas, dada la unión no específica de la tinción fluorescente de células vivas Syto-9™. Este procedimiento se repitió para obtener 3 réplicas biológicas para cada aislado de P. aeruginosa.

Para medir la unión del anticuerpo Psl, se cultivó P. aeruginosa de la misma manera hasta una fase logarítmica temprana de 0,1 DO a 600 nm, de la cual se añadieron 220 µl a los pocillos de un cubreobjetos de vidrio de 8 cámaras y se incubaron durante 24 h a 37 ºC. Después de la incubación, se eliminó el medio y se volvió a agregar LB fresco a los pocillos, luego se dejó incubar durante 24 h más. Al día siguiente, se eliminó el medio y se agregaron 200 µl de LB solo o LB con anticuerpo anti-Psl36 Psl0096-Alexa594 (rojo) (concentración final 56 µg/ml) a los pocillos designados y luego se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, se eliminó el medio y se agregaron 200 µl de Syto-9™ en LB a los pocillos, luego se incubaron durante 45 minutos más. Los pocillos se lavaron 2 veces con LB antes de CLSM en LB.

La cuantificación de la intensidad del biovolumen y la unión del anticuerpo Psl dentro de las biopelículas de P. aeruginosa se calculó, como se describió anteriormente en este documento, utilizando Volocity. Para medir la agregación de P. aeruginosa, se cuantificó la relación superficie-biovolumen utilizando el software Comstat2 como complemento de ImageJ, como se describió anteriormente33.

La actividad metabólica celular de las biopelículas de P. aeruginosa se evaluó mediante un ensayo de ATP adaptado, descrito anteriormente6,35. En resumen, P. aeruginosa se cultivó durante la noche en caldo Muller-Hinton ajustado con cationes (CAMHB) (medio estandarizado para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana) a 37 °C con agitación (225 rpm). El cultivo nocturno se diluyó 1:100 en CAMHB y luego se cultivó hasta una fase logarítmica temprana de 0,1 DO a 600 nm. De este cultivo, se añadieron 220 µl a los pocillos de una placa blanca de 96 pocillos Greiner Medium Binding (Sigma-Aldrich, Oakville, ON) en ausencia o presencia de sobrenadante de esputo al 5 %, luego se incubó durante 24 h a 37 °C sin sacudida. Después de la incubación, se retiró el medio y se agregaron 200 µl de CAMHB en ausencia o presencia de sobrenadante de esputo (dilución final de esputo, 5 %) y tobramicina (concentración final 1000 µg/ml) a los pocillos designados, luego se incubó durante 24 h a 37 °. C. Al día siguiente, se eliminó el medio y los pocillos se lavaron 2 veces con CAMHB y se volvieron a agregar 100 µl de CAMHB a los pocillos. Para medir el ATP en la fracción de los pocillos unida a células, se rompió la base de cada pocillo mediante raspado y se agregaron 100 µl de reactivo Bac Titer-Glo™ (Promega, Madison, WI). Las placas se mezclaron suavemente en un agitador orbital durante 10 minutos en la oscuridad antes de la lectura de luminiscencia según el protocolo del fabricante. Este procedimiento se repitió para obtener tres réplicas biológicas para cada aislado de P. aeruginosa.

Los datos sin procesar de la secuenciación del genoma completo se recortaron usando TRIMMOMATIC con parámetros LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:80. Utilizamos SKA para comparar muestras dentro de los pacientes, antes y después del tratamiento. Para identificar los perfiles de tipificación de secuencias de locus múltiples (MLST), utilizamos la función de tipo ska y para la detección del polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) y la estimación de distancia entre muestras, utilizamos las funciones ska fastq, comparar, fusionar y distancia. En todos los casos se utilizaron parámetros predeterminados37,38.

Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad 5.0. Las variables continuas se compararon mediante la prueba no paramétrica de Mann-Whitney; Se consideró significativo un valor de p < 0,05. Este estudio fue aprobado por la Junta de Ética en Investigación de SickKids (REB#1000079038); Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes y la investigación se realizó de acuerdo con todas las directrices y regulaciones pertinentes.

Todas las imágenes que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en los materiales complementarios como figura complementaria 2. Todos los datos genómicos están disponibles a través de BioProject ID: PRJNA867399 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/867399) .

Shteinberg, M., Haq, IJ, Polineni, D. y Davies, JC Fibrosis quística. Lanceta 397, 2195–2211. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)32542-3 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Pamukcu, A., Bush, A. y Buchdahl, R. Efectos de la colonización por Pseudomonas aeruginosa sobre la función pulmonar y variables antropométricas en niños con fibrosis quística. Pediatra. Pulmonol. 19, 10-15 (1995).

Artículo CAS Google Scholar

McColley, SA y cols. Factores de riesgo de mortalidad antes de los 18 años en fibrosis quística. Pediatra. Pulmonol. 52, 909–915. https://doi.org/10.1002/ppul.23715 (2017).

Artículo de Google Scholar

Mogayzel, PJ Jr. et al. Guía pulmonar de la Fundación de Fibrosis Quística. Enfoques farmacológicos para la prevención y erradicación de la infección inicial por Pseudomonas aeruginosa. Ana. Soy. Torácico. Soc. 11, 1640-1650. https://doi.org/10.1513/AnnalsATS.201404-166OC (2014).

Artículo de Google Scholar

Gascon Casaredi, ISM, Waters, V., Seeto, R., Blanchard, A., Ratjen, F. Impacto de la terapia de erradicación con antibióticos de Pseudomonas aeruginosa en la función pulmonar a largo plazo en la fibrosis quística. J. Fibros quísticos. (2022) (en prensa).

Morris, AJ y cols. El papel de Psl en la imposibilidad de erradicar las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa en niños con fibrosis quística. Microbiomas de biopelículas de NPJ 7, 63. https://doi.org/10.1038/s41522-021-00234-3 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Jackson, KD, Starkey, M., Kremer, S., Parsek, MR y Wozniak, DJ Identificación de psl, un locus que codifica un exopolisacárido potencial que es esencial para la formación de biopelículas PAO1 de Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 186, 4466–4475. https://doi.org/10.1128/JB.186.14.4466-4475.2004 (2004).

Artículo CAS Google Scholar

Ma, L., Lu, H., Sprinkle, A., Parsek, MR & Wozniak, DJ Pseudomonas aeruginosa Psl es un exopolisacárido rico en galactosa y manosa. J. Bacteriol. 189, 8353–8356. https://doi.org/10.1128/JB.00620-07 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

Byrd, MS y cols. Los análisis genéticos y bioquímicos del exopolisacárido de Pseudomonas aeruginosa Psl revelan funciones superpuestas de las enzimas de síntesis de polisacáridos en la producción de Psl y LPS. Mol. Microbiol. 73, 622–638. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2009.06795.x (2009).

Artículo CAS Google Scholar

Yang, L. y col. Funciones distintas de las sustancias poliméricas extracelulares en el desarrollo de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa. Reinar. Microbiol. 13, 1705-1717. https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2011.02503.x (2011).

Artículo CAS Google Scholar

Chew, SC y cols. Remodelación dinámica de biopelículas microbianas mediante exopolisacáridos funcionalmente distintos. MBio 5, e01536-e11514. https://doi.org/10.1128/mBio.01536-14 (2014).

Artículo CAS Google Scholar

Ma, L. y col. Ensamblaje y desarrollo de la matriz de biopelícula de Pseudomonas aeruginosa. Patógeno PLoS. 5, e1000354. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000354 (2009).

Artículo CAS Google Scholar

Waters, VJ y cols. Conciliación de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos y la respuesta clínica en el tratamiento antimicrobiano de las infecciones pulmonares crónicas por fibrosis quística. Clínico. Infectar. Dis. 69, 1812–1816. https://doi.org/10.1093/cid/ciz364 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Somayaji, R. y col. Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos (AST) y resultados clínicos asociados en personas con fibrosis quística: una revisión sistemática. J. Fibros quísticos. https://doi.org/10.1016/j.jcf.2019.01.008 (2019).

Artículo de Google Scholar

DePas, WH y cols. Exponer la biogeografía tridimensional y los estados metabólicos de los patógenos en el esputo de fibrosis quística mediante la inclusión, la limpieza y el etiquetado de ARNr en hidrogel. MBio https://doi.org/10.1128/mBio.00796-16 (2016).

Artículo de Google Scholar

Vidya, P. y col. Los fenotipos de infección crónica por Pseudomonas aeruginosa se asocian con fracaso de erradicación en niños con fibrosis quística. EUR. J.Clin. Microbiol. Infectar. Dis. 35, 67–74. https://doi.org/10.1007/s10096-015-2509-4 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

Mayer-Hamblett, N. et al. Fenotipos de Pseudomonas aeruginosa asociados con fracaso de erradicación en niños con fibrosis quística. Clínico. Infectar. Dis. 59, 624–631. https://doi.org/10.1093/cid/ciu385 (2014).

Artículo de Google Scholar

Bjarnsholt, T. y col. La biopelícula in vivo. Tendencias Microbiol. 21, 466–474. https://doi.org/10.1016/j.tim.2013.06.002 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Jennings, LK y cols. Los agregados de Pseudomonas aeruginosa en el esputo de fibrosis quística producen exopolisacáridos que probablemente impidan las terapias actuales. Representante celular 34, 108782. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.108782 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Staudinger, BJ y cols. Las condiciones asociadas con el defecto de la fibrosis quística promueven la infección crónica por Pseudomonas aeruginosa. Soy. J. Respirar. Crítico. Cuidado médico. 189, 812–824. https://doi.org/10.1164/rccm.201312-2142OC (2014).

Artículo CAS Google Scholar

Secor, PR, Michaels, LA, Ratjen, A., Jennings, LK y Singh, PK La agregación de bacterias impulsada entrópicamente por los polímeros del huésped promueve la tolerancia a los antibióticos en Pseudomonas aeruginosa. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 115, 10780–10785. https://doi.org/10.1073/pnas.1806005115 (2018).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Landry, RM, An, D., Hupp, JT, Singh, PK y Parsek, MR Las interacciones Mucin-Pseudomonas aeruginosa promueven la formación de biopelículas y la resistencia a los antibióticos. Mol. Microbiol. 59, 142-151. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2005.04941.x (2006).

Artículo CAS Google Scholar

Lopatkin, AJ y cols. El estado metabólico bacteriano predice con mayor precisión la letalidad de los antibióticos que la tasa de crecimiento. Nat. Microbiol. 4(12), 2109–2117. https://doi.org/10.1038/s41564-019-0536-0 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Jackson, L. y col. Visualización de Pseudomonas aeruginosa en el esputo de pacientes con fibrosis quística. J. Vis. Exp. JoVE https://doi.org/10.3791/61631 (2020).

Artículo de Google Scholar

Kolpen, M. y col. Las biopelículas bacterianas predominan en las infecciones pulmonares humanas tanto agudas como crónicas. Tórax https://doi.org/10.1136/thoraxjnl-2021-217576 (2022).

Artículo de Google Scholar

Beaudoin, T. y col. La interacción de Staphylococcus aureus con la biopelícula de Pseudomonas aeruginosa mejora la resistencia a la tobramicina. Microbiomas de biopelículas de NPJ 3, 25. https://doi.org/10.1038/s41522-017-0035-0 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

O'Toole, GA et al. Sistemas modelo para estudiar las infecciones polimicrobianas crónicas en la fibrosis quística: enfoques actuales y exploración de direcciones futuras. MBio 12, e0176321. https://doi.org/10.1128/mBio.01763-21 (2021).

Artículo de Google Scholar

Waters, V. Debajo de la superficie: Evaluación de las infecciones pulmonares por fibrosis quística en la era de la terapia moduladora altamente eficaz. J. quiste. Fibros. 20, 723–724. https://doi.org/10.1016/j.jcf.2021.06.008 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Rybtke, M., Jensen, PO, Nielsen, CH y Tolker-Nielsen, T. La matriz de polisacárido extracelular de las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa es un determinante de las respuestas de los leucocitos polimorfonucleares. Infectar. Inmune. 89(1), e00631-20. https://doi.org/10.1128/IAI.00631-20 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Blanchard, AC y cols. Detección precoz mediante qPCR de la infección por Pseudomonas aeruginosa en niños con fibrosis quística en tratamiento de erradicación. J. quiste. Fibros. https://doi.org/10.1016/j.jcf.2018.02.008 (2018).

Artículo de Google Scholar

Blanchard, AC y cols. Efectividad de un protocolo de erradicación gradual de Pseudomonas aeruginosa en niños con fibrosis quística. J. quiste. Fibros. 16, 395–400. https://doi.org/10.1016/j.jcf.2017.01.007 (2017).

Artículo de Google Scholar

Lee, TW, Brownlee, KG, Conway, SP, Denton, M. y Littlewood, JM Evaluación de una nueva definición de infección crónica por Pseudomonas aeruginosa en pacientes con fibrosis quística. J. quiste. Fibros. 2, 29–34 (2003).

Artículo de Google Scholar

Morris, AJ, Li, A., Jackson, L., Yau, YCW y Waters, V. Cuantificación de los efectos de los antimicrobianos en la arquitectura de biopelículas in vitro utilizando el software COMSTAT. Júpiter. https://doi.org/10.3791/61759 (2020).

Artículo de Google Scholar

Kennedy, S. y col. Actividad de la tobramicina contra aislados de fibrosis quística del complejo Burkholderia cepacia cultivados como biopelículas. Antimicrobiano. Agentes Chemother. 60, 348–355. https://doi.org/10.1128/AAC.02068-15 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

Beaudoin, T. y col. Actividad de un nuevo péptido antimicrobiano contra biopelículas de Pseudomonas aeruginosa. Ciencia. Rep. 8, 14728. https://doi.org/10.1038/s41598-018-33016-7 (2018).

Artículo ADS CAS Google Scholar

DiGiandomenico, A. et al. Identificación de anticuerpos humanos ampliamente protectores contra el exopolisacárido Psl de Pseudomonas aeruginosa mediante detección fenotípica. J. Exp. Medicina. 209, 1273–1287. https://doi.org/10.1084/jem.20120033 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Harris, S. SKA: Conjunto de herramientas de análisis Split Kmer para epidemiología genómica bacteriana. bioRxiv https://doi.org/10.1101/453142 (2018).

Artículo de Google Scholar

Bolger, AM, Lohse, M. y Usadel, B. Trimmomatic: un recortador flexible para datos de secuencia de Illumina. Bioinformática 30, 2114-2120. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170 (2014).

Artículo CAS Google Scholar

Descargar referencias

Este estudio fue financiado por la Fundación de Fibrosis Quística (CFF WATERS19AO-1) y Glyconet (ID-03). MRP está financiado por la Fundación de Fibrosis Quística (CFF PARSEK17IO).

Medicina Traslacional, Instituto de Investigación, Hospital para Niños Enfermos, Toronto, ON, Canadá

Amanda J. Morris, Subin Park, Shafinaz Eisha y Valerie J. Waters

División de Microbiología, Departamento de Medicina de Laboratorio Pediátrico, Hospital para Niños Enfermos, Universidad de Toronto, Toronto, ON, Canadá

Yvonne CW Yau

División de Medicina Respiratoria, Hospital para Niños Enfermos, Toronto, ON, Canadá

Nancy McDonald

Departamento de Microbiología, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Mateo R. Parsek

Programa en Medicina Molecular, Instituto de Investigación, Hospital para Niños Enfermos, Toronto, ON, Canadá

P. Lynne Howell

Departamento de Bioquímica, Universidad de Toronto, Toronto, ON, Canadá

P. Lynne Howell

Departamentos de Pediatría y Microbiología, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Lucas R. Hoffman

Laboratorios Meakins-Christie, Instituto de Investigación del Centro de Salud de la Universidad McGill, Montreal, QC, Canadá

Dao Nguyen

Departamento de Medicina, Universidad McGill, Montreal, QC, Canadá

Dao Nguyen

Vacunas y terapias inmunitarias, I+D de productos biofarmacéuticos, AstraZeneca, Gaithersburg, MD, EE. UU.

Antonio Di Giandomenico

División de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Medicina, Universidad de Toronto, Toronto, ON, Canadá

Ashley M. Rooney y Bryan Coburn

Departamento de Biología Celular y de Sistemas, Universidad de Toronto, Toronto, ON, Canadá

Lucía Grana-Miraglia, Pauline Wang y David S. Guttman

Departamentos de Inmunidad y Infección Microbiana, Microbiología, Universidad Estatal de Ohio, Columbus, OH, EE. UU.

Daniel J. Wozniak

División de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Pediatría, Hospital para Niños Enfermos, 555 University Avenue, Toronto, ON, M5G 1X8, Canadá

Valerie J. Aguas

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

AJM, SP, SE, AR, LG y PW realizaron los experimentos. NM obtuvo las muestras de esputo. AJM, SP, SE, AR, LG, PW, YCWY, PLH, MRP, LRH, DN, DSG, BC, DJW y VW contribuyeron al diseño del estudio, la interpretación y análisis de datos y la redacción del manuscrito. AD contribuyó con materiales experimentales y contribuyó a la redacción del manuscrito.

Correspondencia a Valerie J. Waters.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Morris, AJ, Yau, JOC, Park, S. et al. La agregación de Pseudomonas aeruginosa y la expresión de Psl en el esputo se asocian con el fracaso de la erradicación de antibióticos en niños con fibrosis quística. Representante científico 12, 21444 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25889-6

Descargar cita

Recibido: 04 de octubre de 2022

Aceptado: 06 de diciembre de 2022

Publicado: 12 de diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25889-6

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.