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Jun 24, 2023

Heterogeneidad tumoral controlada en un co

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 13648 (2023) Cite este artículo 344 Accesos 15 Detalles de Altmetric Metrics La resistencia al tratamiento del cáncer es causada por la presencia de varios tipos de células y

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13648 (2023) Citar este artículo

344 Accesos

15 altmétrico

Detalles de métricas

La resistencia al tratamiento del cáncer es causada por la presencia de varios tipos de células y la heterogeneidad dentro del tumor. Las interacciones entre células tumorales y entre células y microambiente desempeñan un papel importante en la progresión e invasión del tumor, lo que tiene implicaciones importantes para el diagnóstico y la resistencia a la quimioterapia. En este estudio, desarrollamos modelos in vitro bioimpresos en 3D del microambiente del tumor de cáncer de mama hechos de células cocultivadas distribuidas en una matriz de hidrogel con arquitectura controlada para modelar la heterogeneidad del tumor. Nuestra hipótesis es que el tumor podría representarse mediante una construcción de hidrogel de cocultivo cargado de células cancerosas, mientras que su microambiente se puede modelar en un chip de microfluidos capaz de producir un gradiente químico. Se incluyeron células de cáncer de mama (MCF7 y MDA-MB-231) y células epiteliales mamarias no tumorigénicas (MCF10A) en los hidrogeles de alginato-gelatina y se imprimieron utilizando una bioimpresora de extrusión de cartuchos múltiples. Nuestro enfoque permite un control preciso sobre la posición y la disposición de las células en un sistema de cocultivo, lo que permite el diseño de diversas arquitecturas tumorales. Creamos muestras con dos tipos diferentes de células en ubicaciones iniciales específicas, donde se controló cuidadosamente la densidad de cada tipo de célula. Las células se mezclaron aleatoriamente o se colocaron en capas secuenciales para crear heterogeneidad celular. Para estudiar la migración celular hacia el quimioatrayente, desarrollamos un microambiente químico en una cámara con un gradiente químico gradual. Como prueba de concepto, estudiamos diferentes patrones de migración de células MDA-MB-231 hacia el gradiente del factor de crecimiento epitelial en presencia de células MCF10A en diferentes proporciones utilizando este dispositivo. Nuestro enfoque implica la integración de bioimpresión 3D y dispositivos de microfluidos para crear diversas arquitecturas tumorales que sean representativas de las que se encuentran en varios pacientes. Esto proporciona una excelente herramienta para estudiar el comportamiento de las células cancerosas con alta resolución espacial y temporal.

El cáncer de mama es el cáncer más común en las mujeres y el segundo cáncer más común en general1. En 2018 hubo más de dos millones de casos nuevos y más del 30% de esas mujeres murieron1. La agresividad del cáncer de mama puede deberse a la conocida heterogeneidad de los tumores de mama2. Se ha observado heterogeneidad tumoral entre pacientes (heterogeneidad intertumoral) y en cada tumor individual (heterogeneidad intratumoral), lo que conduce a la agresividad del cáncer de mama y a desafíos en el tratamiento3. Dado que el tumor puede consistir en poblaciones de células cancerosas fenotípicamente diferentes con diferentes propiedades, la muestra de tumor obtenida mediante biopsia no representa la composición exacta del tumor. En el caso de heterogeneidad intratumoral, el tumor consta de diferentes poblaciones de células fenotípicas, que pueden identificarse por diferentes fenotipos celulares, densidad celular o su localización en el tumor4,5.

Los modelos convencionales carecen de heterogeneidad celular espacial del cáncer de mama y generalmente dependen de estímulos o tensiones externos que los hacen desafiantes en la formación y estudio de tumores fisiológicos6. Los modelos de cultivo bidimensionales (2D) tampoco pueden imitar la heterogeneidad y el microambiente del tumor7, mientras que el crecimiento del tumor in vivo ocurre en un entorno tridimensional (3D) en el que las células cancerosas están en constante e íntimo contacto con la matriz extracelular (ECM). y otras células. El desarrollo de modelos de cáncer en 3D proporciona beneficios económicos y éticos para la predicción de la respuesta tumoral al tratamiento al reproducir aspectos importantes de los tumores, como la presencia de gradientes de oxígeno y nutrientes, las interacciones entre células, la penetración de fármacos y las subpoblaciones de células inactivas8. Además, los modelos 3D in vitro están cerrando la brecha entre los estudios 2D e in vivo, reduciendo así el número de animales sacrificados en estudios preclínicos9. Al agregar un sistema de microfluidos a un cultivo 3D en el llamado sistema de tumor en chip, la recapitulación del TME se vuelve aún más precisa, lo que proporciona información valiosa sobre la biología del cáncer10,11.

Se están utilizando plataformas de microfluidos en estudios in vitro para imitar estímulos físicos y químicos en la migración celular, incluida la rigidez ambiental12. También solían investigar la extravasación del cáncer mediante transmisión a través de una monocapa endotelial13, un microambiente perfundible que imita el hueso14 o a través de una red microvascular15,16. Sin embargo, estos dispositivos muestran algunas limitaciones, debido a la miniaturización excesiva, el número deficiente de células y la mayoría de los modelos en 2D. Además de los modelos de tumor en chip, se desarrollan otros modelos in vitro para investigar la migración celular y el mecanismo de metástasis, incluidos los agentes antimetastásicos. Conociendo el papel de la interferencia entre las células cancerosas y las células huésped en la cascada metastásica, se desarrollaron modelos de múltiples capas que pueden imitar un microambiente in vivo relativamente similar17,18. También se utilizan sistemas Transwell (con y sin hidrogel) donde se siembra un tipo de célula particular sobre una membrana porosa y otro en el fondo de una placa de cultivo19,20.

Recientemente, la bioimpresión atrajo mucha atención debido a su capacidad para construir construcciones de tejido mediante el posicionamiento preciso de células y biomateriales en un procedimiento capa por capa21,22. En este método, las células vivas y los componentes de la ECM se imprimen juntos, generando una "biotinta" que puede recapitular la complejidad geométrica y compositiva del microambiente tumoral (TME) al tiempo que preserva la viabilidad celular23,24,25. Los métodos actuales de bioimpresión incluyen inyección de tinta, extrusión e impresión asistida por láser26,27. Entre ellos, el método de extrusión presenta selecciones de materiales versátiles y permite controlar la heterogeneidad del tumor dentro de las matrices impresas mediante un estricto control espacial de distintos tipos de materiales en diferentes ubicaciones iniciales27. Este proceso altamente reproducible también permite la deposición de materiales que tienen incrustadas células de una densidad conocida. La principal ventaja de la tecnología de bioimpresión por extrusión es la capacidad de depositar densidades celulares muy altas, cercanas a las densidades celulares fisiológicas, que es un objetivo importante de los métodos de bioimpresión26,27. La bioimpresión por extrusión se ha utilizado con éxito para construir estructuras de tejido28, estructuras vasculares29,30 y tejidos de la piel31,32 a escala humana, y da como resultado una alta fidelidad de impresión y viabilidad celular.

Nuestro objetivo es establecer una plataforma para modelar la heterogeneidad fenotípica que puede ocurrir debido a la diferente localización celular en un tumor (centro o periferia del tumor, cantidad desigual de oxígeno) y/o interacción con TME. El presente trabajo cubre el diseño y construcción de modelos tumorales in vitro por medios físicos y químicos mediante la bioimpresión 3D de células cocultivadas con distribución controlada en una matriz de hidrogel en un dispositivo de microfluidos. Nuestra hipótesis es que el tumor podría representarse mediante una construcción de hidrogel de cocultivo cargado de células cancerosas, mientras que su microambiente puede modelarse en un chip de microfluidos capaz de producir un gradiente químico. Nuestro hidrogel compuesto como biotinta compuesto de alginato y gelatina, que es compatible con la arquitectura microscópica de un estroma tumoral nativo. Las estructuras cargadas de células, que son células de cáncer de mama incrustadas en los hidrogeles e impresas mediante una bioimpresora basada en extrusión, crearán un modelo de tumor en 3D que imita el microambiente in vivo. Hemos optimizado nuestra biotinta en función de mediciones de imprimibilidad y viabilidad celular. Las construcciones bioimpresas en 3D cocultivadas se desarrollan con la biotinta mejor elegida. Utilizamos una bioimpresora de extrusión de cartuchos múltiples que nos permite desarrollar muestras celularmente heterogéneas compuestas por dos células de cáncer de mama diferentes en ubicaciones iniciales específicas, arquitectura específica con densidad controlada.

Se emplea la ingeniería de un microambiente químico que induce la migración para la creación de una plataforma in vitro para abordar el comportamiento metastásico, que aún no se ha logrado completamente con los modelos tumorales in vitro actuales. Los gradientes químicos extracelulares se manipulan dinámicamente mediante construcciones impresas en 3D que contienen factores de crecimiento en la cámara, lo que permite la modulación celular posterior a la impresión. Este enfoque permite la generación tanto espacial (a través de la impresión 3D) como temporal (a través de la concentración del gradiente y el caudal) de señales químicas en matrices 3D, además de la regulación dinámica de los comportamientos celulares a nivel local. Se está utilizando el factor de crecimiento epitelial (EGF), como prueba de concepto, para modelar la migración de células en la construcción 3D hacia el quimioatrayente. Las células MDA-MB-231 muestran un patrón diferente de migración hacia el gradiente del factor de crecimiento epitelial en el dispositivo cuando la arquitectura del tumor es diferente. Hay pocos trabajos recientes que utilicen plataformas de órgano en un chip para estudiar la heterogeneidad o metástasis en el cáncer de mama33,34. Sin embargo, hasta donde sabemos, no se han informado estudios sobre la bioimpresión 3D de cocultivos en un entorno de microfluidos con arquitectura controlada. Además, la mayoría de los modelos in vitro actuales son modelos 2D o están compuestos por un solo tipo de célula, mientras que para que sea fisiológicamente relevante, el modelo también debe abordar las complejas interacciones celulares dentro del TME. La combinación de estos enfoques de bioimpresión 3D para el modelado de tumores in vitro con dispositivos de microfluidos para modelar el microambiente proporciona herramientas para crear una arquitectura tumoral compleja acompañada de densidades químicas controladas, con una alta resolución espaciotemporal, más allá de lo que es posible con las tecnologías de fabricación convencionales.

La gelatina de piel bovina (tipo B) y la sal sódica del ácido algínico, el dimetilsulfóxido (DMSO), el cloruro de calcio y el polvo de cloruro de sodio se adquirieron en Sigma-Aldrich (Canadá). Se disolvió cloruro de calcio en agua Millipore a una concentración final del 4%, se filtró con filtros de 0,2 u y se almacenó en condiciones estériles para su uso posterior. Para estudios de cultivo celular, se adquirieron líneas celulares MCF7 y MDA-MB-231 de ATCC (Cedarlane, Canadá). DMEM (Medio de Eagle modificado por Dulbecco, sin piruvato de sodio, con 4,5 g/l de glucosa, con L-glutamina), PBS (solución salina tampón fosfato) 1×, Penicilina-estreptomicina, Solución de tripsina/EDTA al 0,25% (p./v. ) y FBS (suero bovino fetal) se adquirieron de Wisent Bioproducts (Canadá). (Bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2H-tetrazolio) MTT en polvo, Triton X-100, BSA (albúmina sérica bovina), paraformaldehído, un ensayo de viabilidad de células vivas/muertas El kit (CBA415) y el tinte de núcleos Hoechst 33342, el yoduro de propidio (PI) y la calcina se compraron en Sigma-Aldrich (Canadá). Para la bioimpresión, la jeringa mezcladora (5 ml) con una proporción de mezcla de 4:1 y las puntas mezcladoras compatibles se adquirieron en Sulzer Inc. (Suiza). Cartuchos vacíos y boquillas adquiridos en Cellink (Suecia)

El alginato de sodio y la gelatina (tipo A, 90–110 flores derivadas de piel porcina) se compraron en Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Se prepararon formulaciones de biotinta con diversas proporciones de alginato y gelatina. De acuerdo con el protocolo proporcionado por Ouyang et al.35, primero se disolvieron mezclas de gelatina y alginato en polvo con diferentes proporciones en una solución salina de cloruro de sodio al 0,5%. Luego la solución se agitó vigorosamente sobre una placa caliente a 85ºC durante media hora. Los hidrogeles se colocaron debajo de una cabina de bioseguridad y se trataron con luz ultravioleta durante 20 minutos. Posteriormente, todas las formaciones de biotinta se mantuvieron a temperatura ambiente (23–24 °C) durante 2 a 4 h antes de las pruebas reológicas y se guardaron en un refrigerador (4 °C) para un almacenamiento más prolongado. Todos los experimentos posteriores se realizaron a temperatura ambiente.

Utilizamos dos tipos de células para nuestros experimentos: líneas celulares de cáncer de mama MCF7 y MDA-MB-231 adquiridas en ATCC. Las células se pasaron una o dos veces por semana y se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina, llamado posteriormente DMEM completo, según lo recomendado por el proveedor. Los experimentos se realizaron con células pasadas menos de diez veces. La mezcla de células e hidrogel se realizó en una cabina de bioseguridad con jeringas de mezcla duales en una proporción de 4:1 (gel:célula). Los cartuchos de biotintas que contenían células se utilizaron inmediatamente para la bioimpresión en condiciones estériles.

Se utilizó CELLINK INCREDIBLE+ (CELLINK AB) para la impresión de construcciones cargadas de células individuales y múltiples. Las biotintas se cargaron en cartuchos de impresión esterilizados y la biotinta se extruyó a través de boquillas utilizando cabezales de impresión basados ​​en extrusión. Para la impresión secuencial de dos celdas diferentes, se han utilizado dos cartuchos separados. El flujo de material para cada cabezal de impresión fue controlado por reguladores individuales de presión y velocidad. La velocidad de movimiento de la aguja se ajustó a 5 mms-1. Las estructuras predefinidas se implementaron utilizando el software Solidworks y se cortaron en el software sli3r en 10 capas con un patrón de relleno rectilíneo (Fig. 1A). La imprimibilidad de hidrogeles de alginato-gelatina, utilizando una combinación de diferentes composiciones de hidrogel y presiones de impresión, se evaluó (Tabla complementaria 1, Información de respaldo) utilizando una boquilla cónica estéril de alta precisión 22G (diámetro interior de 0,41 mm). Todos los componentes de la preparación de biotinta se esterilizaron antes de la impresión utilizando UV en BSC y sumergiéndolos en etanol al 70% durante 1 h. Polvos de alginato y gelatina esterilizados bajo BSC UV durante 20 min. Se agrega agua esterilizada al polvo y se tapa el recipiente. Luego se pone el recipiente sobre placa caliente durante 1 h a 85 ºC con agitación magnética. La tinta preparada se coloca bajo luz UV BSC hasta que se enfríe antes de mezclarla con las células. La impresora, la plataforma de impresión y el cabezal de impresión se mantuvieron a temperatura ambiente. Posteriormente, las construcciones bioimpresas se sumergieron en CaCl2 estéril al 4% (p/v) durante 10 minutos para reticular el alginato de sodio con iones de calcio. Después de 10 minutos, las construcciones cargadas de células se lavaron tres veces con PBS, se sumergieron en un medio de crecimiento (DMEM) que contenía 10 % de FBS y 1 % de penicilina/estreptomicina y se incubaron (37 °C, 5 % de CO2) para su posterior análisis. El medio de cultivo se cambió cada dos días.

(A) La ilustración esquemática del proceso de biofabricación, (B) la impresora y las construcciones bioimpresas (colorante alimentario utilizado con fines ilustrativos).

La viabilidad celular se evaluó mediante MTT y ensayos de vivos y muertos, en estructuras bioimpresas inmediatamente después de la impresión y después de 4, 7 y 11 días. Las propiedades de viabilidad celular de las construcciones se determinaron utilizando un kit de viabilidad de tinción Live/Dead según las instrucciones del fabricante. Brevemente, cada construcción se sumergió en una solución de tinte Calcine-AM 1 µM y se incubó durante 1 h a 37 °C. Luego se aspira la solución y las construcciones se sumergen en una solución de yoduro de propidio 2 µM y se mantienen en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se eliminó la solución colorante y las construcciones se empaparon en PBS durante 15 minutos dos veces. Se utilizó un microscopio confocal de barrido láser (Zeiss LSM 700) para obtener imágenes de células vivas y muertas en las construcciones en cinco réplicas técnicas. Se utilizaron tres construcciones (tres réplicas biológicas) (n = 3) para analizar la viabilidad celular cuantitativa. Con base en las imágenes vivas y muertas, las viabilidades cuantitativas de las células se contaron manualmente utilizando el software ImageJ (NIH) y se calcularon en función del número de células vivas (células teñidas de verde) sobre el número total de células (vivas + muertas).

La proliferación celular dentro de la red 3D de tres réplicas biológicas se analizó mediante el ensayo MTT. Se agregaron 900 µl de DMEM y 100 µl de solución de trabajo de MTT (0,5 mg ml-1 en PBS) a cada pocillo de una placa de 12 pocillos en cada construcción y se incubaron durante 3 h a 37 °C, 5 % de CO2. En el momento programado, se descartó el medio y las células se lavaron dos veces con PBS. Las membranas celulares y los cristales de formazán insolubles se disolvieron utilizando 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) en cada estructura durante 30 minutos, protegidos de la luz. La solución obtenida se transfirió a un multipocillo de 96 y se evaluó la densidad óptica a 540 nm utilizando un lector de microplacas de absorbancia (Biotek Synergy H1, Agilent). Los resultados de la viabilidad celular se expresaron como absorbancia UV-Vis de cada muestra en comparación con la absorbancia del control negativo, que es un prototipo de construcción 3D sin células para excluir la interferencia del polímero en la lectura UV-Vis.

Los kits de enlace celular fluorescente PKH67 y PKH26 se utilizaron empleando tecnología patentada de etiquetado de membrana para incorporar de manera estable un tinte fluorescente verde y rojo con largas colas alifáticas en regiones lipídicas de la membrana celular36. El diluyente C se utiliza como vehículo de etiquetado para mantener la viabilidad celular y al mismo tiempo maximizar la solubilidad del tinte y la eficiencia de la tinción durante el paso de etiquetado. Las células se centrifugaron y se suspendieron en un medio sin suero (solo DMEM). Se añadieron 4 µl de PKH67 (verde) o PKH26 (rojo) a 1 ml de diluyente C y se mezclaron bien para dispersar. Los sedimentos celulares se dispersaron en 1 ml de diluyente C. Rápidamente, la solución de suspensión celular y la solución de tinte se mezclaron y homogeneizaron mediante pipeteo suave y se incubaron a 37 °C durante 5 minutos. La tinción se detuvo añadiendo 10 ml de medio completo (DMEM + 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina). Las células se centrifugaron y se lavaron con DMEM sólo dos veces más para asegurar la eliminación del tinte no unido.

Todas las construcciones se examinaron para obtener imágenes de campo brillante y un microscopio de imágenes fluorescentes utilizando Nikon Eclipse Ti2 mediante filtros apropiados. Se utilizó un microscopio confocal de barrido láser (Zeiss LSM 700) para observar la morfología celular y la distribución celular dentro de las construcciones impresas en 3D. En cada posición de observación, se implementó un escaneo de pila Z (400 μm de espesor) con pasos de 5 o 10 μm con aumentos de ×4.

Las mediciones reológicas de las formulaciones de biotinta se realizaron con un reómetro Malvern Kinexus Ultra+ con una geometría de placa paralela de 20 mm con un espacio de 1 mm. Para cargar la muestra de hidrogel, se colocó el hidrogel en la placa inferior del reómetro y se bajó la geometría de la placa de acero hasta que se estableció contacto con la superficie de la muestra de biotinta. Posteriormente, se eliminó el exceso de muestra alrededor de la placa con una espátula. Los módulos elástico y viscoso de los hidrogeles se evaluaron a 25 °C y 15 °C con una deformación del 0,1%. Las viscosidades de todas las muestras se midieron a 25 °C a una velocidad de corte de 1 a 100 s-1. El módulo elástico de corte G ′, el módulo de pérdida de corte G ″ y la tangente de pérdida tan (δ) se midieron para cada biotinta de hidrogel utilizando una prueba de barrido de tensión de corte que oscila entre 0,02 y 1,0% a una frecuencia de oscilación de 40 Hz. Todas las mediciones reológicas se realizaron por triplicado.

Diseño Se diseña un generador de gradiente en forma de árbol que se puede integrar con la bioimpresión 3D para el modelo de tumor en chip. El dispositivo contiene dos entradas para la inyección del medio de cultivo así como del reactivo de interés. Se producirá un gradiente lineal del reactivo a través de una cámara mientras los materiales de desecho salen del dispositivo a través de seis salidas al lado de esta cámara. Se utilizó un algoritmo para encontrar la longitud de las ramas en cada paso de los canales de mezcla, asumiendo que el ancho de los canales y su altura eran 400 μm y 50 μm respectivamente. Todo el modelo tiene 21 mm de ancho y 45 mm de largo.

Fabricación Se siguió un procedimiento de litografía estándar para fabricar un generador de gradiente de microfluidos. Brevemente, se hizo girar una capa de 50 μm de espesor de fotoprotector negativo SU8-2050 sobre una oblea de Si limpia y luego se modeló y reveló enjuagando con grabador SU8 para formar el molde para los microcanales. A continuación, se extendió una proporción de 10:1 de PDMS sobre el molde y se dejó durante 12 h a 65 °C para que polimerizara completamente. Se despegó el chip fundido en PDMS y se perforaron agujeros en la ubicación de las entradas y salidas. El área de la cámara también se cortó usando una cuchilla para abrir algo de espacio para la impresión del tumor. Luego, la capa de PDMS se unió a un portaobjetos de vidrio usando plasma de oxígeno en un limpiador de plasma. El chip de microfluidos preparado se expuso a luz ultravioleta para su desinfección antes de bioimprimir los tumores directamente en la cámara o transferirlos a la cámara. Se activó otro portaobjetos de vidrio usando plasma de oxígeno y se selló la parte superior de la cámara. Inmediatamente se introdujo un flujo de medio de cultivo celular usando una bomba de jeringa a través de las entradas para proporcionar viabilidad celular. Luego se cambió la fuente en una de las entradas con el reactivo de interés para formar el gradiente en la cámara. El dispositivo se mantuvo dentro de una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante todo el experimento y se examinó periódicamente.

En este estudio se construyeron tres modelos de cultivo celular, incluido un modelo 2D, un modelo de bioimpresión 3D secuencial y una bioimpresión 3D cocultivada, todo ello en el dispositivo de microfluidos. El modelo 2D se preparó simplemente cultivando células MCF7 y MDA-MB-231 en placas de 12 pocillos hasta una confluencia del 80 % a menos que se indique lo contrario. Para los experimentos de cocultivo, las células se marcaron con diferentes marcadores fluorescentes antes de cultivarlas para obtener una visibilidad distinta mediante un microscopio fluorescente durante el experimento. Para la bioimpresión secuencial, se preparó un código G para que la bioimpresora permita cambiar entre dos cabezales de impresión en capas alternativas en las que cada capa se imprimió con una de las biotintas, incluidas las células tipo A o tipo B. Para las construcciones bioimpresas de células mixtas, se marcaron dos tipos de células diferentes con marcadores verdes o rojos para que fueran distinguibles. El hidrogel se mezcló con células con la proporción deseada de dos células y la proporción deseada de gel a células. Se preparó e imprimió un cartucho de células mixtas capa por capa. Para los experimentos con chips de microfluidos, las construcciones se imprimirán directamente en la cámara de microfluidos o se transferirán a la cámara más tarde, según la prueba diseñada.

En el estudio preliminar, se prepararon e imprimieron varios hidrogeles con alginato del 1 al 10 % y gelatina del 4 al 10 % a temperatura ambiente utilizando la bioimpresora INKREDIBLE (Cellink, Suecia). El pequeño diámetro de la boquilla da como resultado una mayor resolución, pero aumenta el daño celular debido a la alta presión de extrusión. Por otro lado, estudios previos informaron que se obtuvo una baja fidelidad de forma con un mayor diámetro de boquilla con impresión a baja presión26. Sin embargo, proporciona una mejor condición para la viabilidad celular. Se ha encontrado una relación cuantitativa entre el tamaño de la boquilla y la presión de dispensación sobre la viabilidad celular37. Aquí, cada hidrogel se imprimió con dos diámetros de boquilla, 25 G (rojo, 250 µm de diámetro interior) y 22G (azul, 410 µm de diámetro interior). La Figura 1A muestra la ilustración esquemática del proceso de biofabricación y las estructuras impresas y la Figura 1B muestra las construcciones impresas. Continuamos con la bioimpresión con una boquilla 22G que necesita menos presión de extrusión y resultó favorable para la viabilidad celular después de la impresión. Después de producir biotinta mezclando hidrogel y células, el procedimiento de bioimpresión se aplicó secuencialmente mediante dos cabezales de impresión que contenían células de tipo A y células de tipo B, por separado. Luego, la construcción impresa se sumergió en CaCl2 para reticular durante 10 minutos. Después de lavar con PBS, cada construcción se sumergió en medio celular (DMEM, con 10% de PBS, 1% de Pen-Stripe) y se incubó a 37 °C. La Tabla complementaria 1 (Información de respaldo) resume la presión aplicada, la condición del filamento y la calidad de la estructura impresa según el tamaño de la boquilla y la composición del hidrogel.

Para visualizar la distribución de las células en la construcción impresa, las membranas celulares se tiñeron previamente con un marcador de membrana fluorescente verde (PKH67) antes de imprimir y se tomaron imágenes inmediatamente después de imprimir con un microscopio confocal. La Figura 2A muestra que las células se distribuyeron homogéneamente en la construcción. La viabilidad de diferentes células después de la impresión se determinó mediante un ensayo de tinción de muertos vivos. Los reactivos de tinción vivos/muertos se agregaron a cada estructura inmediatamente después de la bioimpresión, como se describe en la sección experimental. El estado de supervivencia celular se definió como la relación porcentual de células vivas sobre el total de células, donde la fluorescencia verde de acetoximetilo de calcio tiñó las células vivas y la fluorescencia roja de yoduro de propidio tiñó las células muertas. La viabilidad celular es un factor esencial para la fabricación exitosa de construcciones impresas con células. Los resultados del ensayo de muertos vivos (Fig. 2B) muestran que el porcentaje de células MDA-MB-231 viables inmediatamente después de la impresión fue del 94,16 %, 96,94 %, 75,96 % y 84,7 % para los hidrogeles A1G4, A4G4, A8G4 y A1G8 respectivamente. La imagen de representación relacionada con A4G4 con verde muestra células vivas y rojo indica células muertas presentadas en la Fig. 2C. La pila z 3D se muestra en la Fig. 2D, lo que confirma la homogeneidad de las células vivas en la construcción.

La distribución uniforme y la viabilidad de las células MDA-MD-231 bioimpresas. (A) Concentración y distribución de células impresas en la construcción, barras de escala, 50 μm (B) El histograma muestra la viabilidad de las células en las mezclas de hidrogel inmediatamente después de la impresión. (Estado de supervivencia celular según el porcentaje de células vivas/muertas). Los datos se expresan como el promedio ± desviación estándar de cinco réplicas técnicas de tres muestras biológicas replicadas. Tinción de muertos vivos de cuatro mezclas de hidrogel diferentes con células MDA-MB-231 después de la bioimpresión. (C) La imagen representativa relacionada con A4G4 con el verde muestra células vivas y el rojo para células muertas, barra de escala, imagen representativa confocal 3D de 50 μm (D) para hidrogel A4G4. (E) Resultados del ensayo MTT en construcciones bioimpresas con hidrogel A4G4, inmediatamente después de la impresión (día 1), después de 4 días, después de 7 días y después de 11 días. Los datos se expresan como el promedio ± desviación estándar de tres réplicas biológicas de muestras y tres réplicas biológicas de controles negativos (barras pequeñas de color rojo).

El ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) se realizó en tres réplicas de construcciones bioimpresas en 3D inmediatamente después de la impresión y después de la incubación a 37 °C, 5 % de CO2 en DMEM con 10% FBS y 1% Penicilina-estreptomicina durante 4, 7 y 11 días. Los resultados de la prueba MTT se informan en la Fig. 2E como datos de absorbancia detectados a 570 nm. Los datos se refieren a tres réplicas de construcciones bioimpresas en 3D y tres réplicas de construcciones de control negativo (barras pequeñas) que son estructuras impresas en 3D sin células. Se puede observar una distribución celular claramente buena en la construcción con valores de absorbancia de ~ 0,86 ± 0,02 inmediatamente después de la impresión. Se midió un incremento de absorbancia después de la incubación durante 4 días (1,39 ± 0,05) y continuó hasta alcanzar 1,94 ± 0,04 el día 7. La tasa de viabilidad, en comparación con el día 1, aumentó durante la semana, pero en el día 11, la absorbancia fue 2,07 ± 0,06, lo que muestra una caída en la tasa de proliferación celular. Parece que entre el día 7 y el día 11 las construcciones alcanzan la capacidad máxima para albergar células y posteriormente algunas células comenzaron a morir.

Las células cancerosas MCF7 (una línea celular de adenocarcinoma de mama) y MDA-MB-231 (una línea celular de cáncer de mama triple negativo más agresiva con características mesenquimales) se tiñen previamente con marcadores verdes y rojos antes de imprimir, respectivamente. En el primer procedimiento de impresión, se prepararon dos biotintas por separado de cada tipo de célula y se imprimieron de forma secuencial. La primera capa de la estructura impresa constaba de células MDA-MB-231 (teñidas de rojo) y la segunda capa de células MCF7 (teñidas de verde) se encontraba encima de la primera capa. En el segundo experimento de impresión, se preparó una biotinta con una mezcla de ambas células preteñidas en el hidrogel y la bioimpresión se realizó capa por capa como antes. Las Figuras 3A, B muestran la imagen confocal de las células bioimpresas secuenciales y la estructura bioimpresa que consiste en una mezcla de ambas células, respectivamente. En un experimento separado, la mezcla de células MCF7 y MDA-MB-231 se cocultivó en una cámara 2D. Se puede ver que la población celular y la proporción de células son diferentes en los bordes de la cámara en comparación con el centro de la cámara, mientras que en la estructura bioimpresa en 3D, las células están ubicadas de manera homogénea (Fig. 3C-E). Aunque también es posible cocultivar células en condiciones 2D sembrándolas sobre una fina capa de hidrogel para proporcionar las señales químicas adecuadas, el control de la distribución precisa de las células sería muy difícil. Cabe señalar que se prepararon cultivos de células individuales de células MCF7 y MDA-MB-231 con y sin tinción celular para observar el efecto de la tinción sobre el crecimiento celular. El cocultivo con una mezcla de ambas células también se preparó con y sin tinción celular. El crecimiento celular se observó bajo un microscopio después de 3 días y 5 días en ambas condiciones. No se observaron diferencias notables entre cultivos de células con tinción y sin tinción, lo que muestra que el procedimiento de tinción no tiene un efecto adverso sobre el crecimiento celular (datos no mostrados aquí).

Imágenes confocales renderizadas en 3D de células MCF7 (teñidas de verde) y MDA-MB-231 (teñidas de rojo): (A) Impresión secuencial de MDA-MB-231 y MCF7, (B) bioimpresión de una construcción utilizando una biotinta con una mezcla de células MCF7 y MDA-MB-231; Cultivo 2D de ambas mezclas de células con una proporción de 2:1 (MCF7, verde:MDA-MB-231, rojo): (C) Borde de la cámara de cultivo, (D) Centro de la cámara, (E) Bioimpresión 3D de Mezcle las celdas con una proporción de 2:1 (verde:rojo). Barras de escala, 50 µm.

Para investigar el crecimiento y la agregación celular en cocultivos bioimpresos, se imprimió por separado una construcción 3D que consta de cada tipo de célula y se comparó con la construcción que consiste en la mezcla de ambas células en la biotinta. Se utilizó un microscopio confocal para observar la morfología de las células MCF7 y MDA-MB-231 durante un período experimental de 10 días en construcciones similares a tumores (Fig. S2, Información de respaldo). Las imágenes confocales de construcciones bioimpresas en 3D de cocultivo muestran que en el día 1, tanto las células MCF7 (roja) como las MDA-MB-231 (verde) están presentes en cada capa de forma aleatoria a medida que se imprimieron. Después de 3 días, se pueden observar ambas líneas celulares, pero parece que las células están presentes en diferentes capas y migraron para formar grupos de células. "Parece que es más probable que las células MCF7 migren a MDA-MB-231 en lugar de otras células MCF7, ya que se observaron más grupos de tipos de células mixtas en comparación con pocos grupos de células MCF7 que también se observan". La migración celular dentro del hidrogel es consistente con informes anteriores que investigan el tamaño de los poros de los hidrogeles de alginato-gelatina38,39.

Aquí, utilizamos el factor de crecimiento epitelial (EGF), un material quimioatrayente, para observar la migración celular en cocultivos del dispositivo de microfluidos. Los gradientes biomoleculares extracelulares se generan dinámicamente dentro de matrices de hidrogel 3D a través de un gradiente lineal diseñado para imitar entornos químicos en tejidos tumorales y dirigir la migración celular. Se utilizó un algoritmo para encontrar la longitud de las ramas en cada paso de los canales de mezcla, asumiendo que el ancho de los canales y su altura eran 400 μm y 50 μm, respectivamente. Todo el modelo tiene 21 mm de ancho y 45 mm de largo. La Figura 4A muestra la simulación COMSOL de este dispositivo en la que las ecuaciones de Navier-Stokes y Convección-Difusión se resuelven utilizando el método de elementos finitos. En esta figura, los colores rojo y azul representan concentraciones mayores y menores en [mol/mm3], respectivamente. Se consideró que el coeficiente de difusión era 109 m2/s, que es un valor típico en soluciones acuosas. Se suponía que agua pura como disolvente y 1 [mol/mm3] de solución acuosa entrarían en el chip a través de las entradas 1 y 2, respectivamente.

(A) La simulación COMSOL del dispositivo con rojo y azul representa concentraciones más altas y más bajas, (B) formación de gradiente en los intervalos de 5 minutos. La migración de MDA-MB-231 (verde) y MCF10A (rojo) hacia EGF en la cámara de microfluidos; fotografiado en el concentrado superior de la cámara antes y después del flujo en gradiente de EGF: relación MDA-MB-231/MCF10A 1:1 (S11) (C), relación MCF7/MCF10A 1:4 (S14) (D) y MDA-MB -231/MCF10A relación 4:1 (S41) (E). Para cada panel se muestra el porcentaje respectivo de células MDA-MB-231 antes y después de la exposición al EGF.

Para confirmar el gradiente químico, se utilizaron el medio de cultivo celular y FBS como fuente en las entradas para producir una confirmación visual de difusión. La Figura 4B muestra la imagen de la cámara con intervalos de 5 min aplicando un caudal de 20 l/min. El gradiente se ha producido y obtenido durante al menos 5 h sin flujo. El cocultivo construido de MCF7 mixto y MDA-MB-231 (Fig. 3B) se probó para el estudio de migración de dos células cancerosas diferentes hacia el quimioatrayente (datos no mostrados). La migración de MDA-MB-231 fue más notable que la de las células MCF7 (como se esperaba) y elegimos MDA-MB-231 para el estudio de la migración celular en el siguiente paso. Nuestros resultados concuerdan con estudios previos de migración de células MCF7 y MDA-MB-231 hacia quimioatrayentes en dispositivos de microfluidos40.

Las construcciones bioimpresas, incluidas MDA-MB-231 (etiquetadas en verde) y MCF10A (etiquetadas en rojo), se colocaron en la cámara de gradiente. Se usó un caudal de 5 µl/min con los medios de cultivo celular como fuente para la salida 1 y medios de cultivo celular con EGF 100 nM como fuente de salida 2. El gradiente se introdujo en las células durante 8 h mientras todo el dispositivo se mantuvo a 37 °C con 5% de CO2.

La Figura 4C-E muestra diferentes arquitecturas tumorales de células MDA-MB-231 y MCF10A bioimpresas con proporciones de MDA-MB-231/MCF10A: 1/1 (S11), 1/4 (S14) y 4/1 (S41). ). Los paneles de la izquierda muestran la distribución de MDA-MB-231 y MCF10A en el tumor antes de aplicar EGF y los paneles de la derecha muestran su distribución después de aplicar EGF. Para cada panel, se calculó y se muestra en los gráficos el porcentaje total de células MDA-MB-231 antes y después de la exposición al EGF. La tendencia de migración más alta se observa cuando la proporción de células cancerosas con respecto a las células no cancerosas circundantes es de 1:1 (Fig. 4C).

Se ha observado heterogeneidad tumoral entre los pacientes. Los tumores de mama son heterogéneos y constan de muchos tipos de células diferentes que crean el TME. El desarrollo del tumor y las células del microambiente tienen una influencia bidireccional entre sí mediante la secreción de citoquinas, factores de crecimiento, etc. Además de la heterogeneidad entre las células cancerosas y las células estromales, los tumores individuales también muestran heterogeneidad, que se observó por primera vez hace unas cuatro décadas en modelos murinos3 y se denomina heterogeneidad intratumoral. Dentro de los cánceres individuales, existen distintas subpoblaciones de células cancerosas con capacidad metastásica variable debido a sus diferentes representaciones de tumorigenicidad, vías de señalización, migración y respuesta a los fármacos anticancerígenos5,41. Como resultado, un modelo eficaz no sólo debe proporcionar un microambiente para el crecimiento celular en 3D, sino también permitir las interacciones entre células para estudiar la progresión del cáncer. Cualquier modelo de tumor en chip debe cubrir la heterogeneidad del tumor para ser preciso.

Antes se crean varios modelos de tejido en 3D para estudiar dos de los factores más importantes en la mortalidad por cáncer, la angiogénesis y la metástasis42. En muchos casos de metástasis, la muerte se debe a metástasis a distancia a otros órganos y tejidos43,44. El modelado de angiogénesis también es un factor crítico en el desarrollo tumoral y la metástasis, lo que permite la investigación de las interacciones de las células endoteliales vasculares con las células cancerosas, incluido el cocultivo de células tumorales con células endoteliales, vasos explantados o células sembradas rodeadas por hidrogeles cargados de células tumorales45. 46,47. Aquí, nuestro objetivo es establecer una plataforma que utilice bioimpresión 3D para modelar la heterogeneidad fenotípica, que es el resultado de una localización celular diferente en un tumor utilizando tumores bioimpresos.

Las propiedades intrínsecas del material (incluido el módulo, el límite elástico y la viscosidad) son el factor más importante para su imprimibilidad y algunas otras condiciones externas también son importantes, como la presión aplicada y la geometría de la boquilla48. El componente clave para el éxito de la impresión 3D de tumores es el desarrollo de una biotinta adecuada. Los hidrogeles, con aproximadamente un 99% de contenido de agua, son los principales candidatos para la bioimpresión ya que su gran cantidad de agua favorece el atrapamiento de entidades biológicas y aumenta la biocompatibilidad del hidrogel49. Además, tienen impactos significativos en la proliferación, migración, agregación y actividades celulares que dependen en gran medida de las propiedades físicas de los hidrogeles50. Hasta la fecha, se han utilizado varios tipos de polímeros sintéticos y naturales para preparaciones de hidrogel con diferentes biocompatibilidades y propiedades mecánicas50. Los polímeros con baja citotoxicidad y similitud estructural con la ECM son buenos candidatos para fabricar biotintas. Los requisitos principales para un material de bioimpresión son (a) viabilidad celular, (b) imprimibilidad (adelgazamiento por cizallamiento, presión de impresión compatible, extrusión continua sin burbujas de aire), (c) estabilidad estructural (estabilidad de una estructura impresa antes y después de la reticulación). ), y (d) reticulación rápida y no tóxica51.

La biotinta ideal para la bioimpresión con métodos de extrusión debe tener una viscosidad relativamente alta, mostrar un fuerte comportamiento de adelgazamiento y una rápida reticulación después de la impresión. Por lo tanto, los polímeros naturales como el alginato, la gelatina, el quitosano y los hidrogeles de ácido hialurónico han atraído más atención debido a su alta compatibilidad con los entornos celulares y su buen control sobre la cantidad de proteínas de la MEC y factores de crecimiento51. Un hidrogel ampliamente investigado es el alginato, un polisacárido natural derivado de algas que es único porque sufre una transición sol-gel en presencia de cationes divalentes como el calcio. También tiene propiedades óptimas de encapsulación celular como proceso de gelificación lento a temperatura ambiente52,53. Sin embargo, el alginato muestra malas propiedades mecánicas. La gelatina es un material muy elástico en lugar de viscoso y se considera una biotinta sólida rígida a temperatura ambiente9, lo que no es ideal para los métodos de bioimpresión por extrusión. Por otro lado, si se mezcla gelatina con hidrogeles de alginato para formar un gel en fase líquida, se puede lograr una condición óptima para la bioimpresión por extrusión. Informes anteriores estudiaron combinaciones de gelatina y alginato compatibles con bioimpresoras de extrusión51,54. También han demostrado que la gelatina proporciona características elásticas en el hidrogel, mejora la adhesión celular, contribuye a la viscosidad del hidrogel y añade rigidez55,56.

Una tensión de corte elevada puede provocar daños en la membrana celular. Por lo tanto, la capacidad de adelgazamiento por cizallamiento es importante para reducir la tensión de cizallamiento impartida a las células durante el proceso de extrusión. Para que una biotinta se considere imprimible debe brindar la oportunidad de fabricar una estructura porosa multicapa sin colapsar ni hundirse después de la impresión. Para que nuestra tinta sea imprimible, debe presentar un límite elástico suficiente para evitar su colapso, tener una extrusión suave desde la boquilla de manera que no aparezca corrugación y no debe mostrar "picos y valles" a lo largo del extruido ni roturas dentro de un filamento.

Desarrollamos varios hidrogeles con alginato entre 1% y 10% y gelatina entre 4% y 10% y los imprimimos a temperatura ambiente. Al aumentar la concentración de alginato del 1 al 8% mientras se mantiene la concentración de gelatina en aproximadamente el 4%, la calidad del filamento mejora, lo que concuerda con el informe de Giuseppe57 de que aumentar la concentración de alginato y gelatina dio como resultado una impresión más precisa. Sin embargo, aumentar la concentración de gelatina en más de un 4% reduce la precisión de la impresión. También necesita una mayor presión de extrusión debido al atasco de las boquillas. Por otro lado, las propiedades sinérgicas del alginato-gelatina hicieron que la combinación de alginato al 1% y gelatina al 8% siguiera siendo una buena candidata para una impresión precisa.

Se pueden considerar varios criterios para las propiedades mecánicas de la biotinta, pero el más importante es la reología9. La reología es la medida de la deformación de un material causada por la fuerza que actúa sobre él y la gran mayoría de las caracterizaciones reológicas de las biotintas se han centrado en la viscosidad del hidrogel. Se han estudiado las propiedades reológicas de muestras de hidrogel para cuatro combinaciones de A1G4, A1G8, A4G4 y A8G4 (mientras que A1G4 representa alginato 1%, gelatina 4%, etc.) con la mejor imprimibilidad. Los hidrogeles con mayor viscosidad experimentan altas fuerzas de cizallamiento para extruirse a través de la boquilla durante la impresión. El comportamiento de adelgazamiento por cizallamiento permite imprimir hidrogeles altamente viscosos con precisión estructural58. Como se puede ver en la Fig. S1C, la viscosidad de todas las mezclas de hidrogeles disminuyó al aumentar la velocidad de corte y se observó el comportamiento de adelgazamiento del corte en las cuatro muestras. Las curvas de viscosidad de todas las mezclas de hidrogel mostraron un patrón similar, lo que sugiere que todos los hidrogeles tuvieron un comportamiento de adelgazamiento por cizallamiento. Según la observación de los datos del módulo de pérdida y almacenamiento de los hidrogeles ilustrados en la Fig. S1D, A4G4 muestra el módulo de almacenamiento (elástico) más alto.

La composición y las propiedades mecánicas del hidrogel juegan un papel importante en la viabilidad celular. Según los resultados del ensayo de muertos vivos que se mostraron anteriormente en la Fig. 2B, el porcentaje de células MDA-MB-231 viables inmediatamente después de la impresión fue del 94,16 %, 96,94 %, 75,96 % y 84,7 % para los hidrogeles A1G4, A4G4, A8G4. y A1G8 respectivamente. Una gotita del hidrogel A1G8, como representante del gel no impreso, se colocó en CaCl2 para su reticulación y se sometió a un proceso de ensayo de vida-muerte. La viabilidad celular para A1G8 antes de la impresión también se obtuvo como 93,4%, que es ligeramente superior a la del bioimpreso (84,7%), lo que está de acuerdo con el procedimiento de extrusión que afecta la viabilidad celular. A1G4 y A4G4 muestran los mejores resultados de viabilidad celular; sin embargo, A1G4 no tuvo una buena fidelidad de forma en la estructura del hidrogel. Por lo tanto, según los resultados de imprimibilidad y viabilidad, se eligió A4G4 como el hidrogel optimizado que se utilizará en los experimentos de cocultivo. La excelente viabilidad obtenida a partir de una mezcla de 4% de alginato y 4% de gelatina se puede atribuir a la naturaleza blanda del gel y a la adhesión celular que la gelatina introdujo en el hidrogel. Informes anteriores confirmaron que cuando las concentraciones de alginato disminuyen en las composiciones de hidrogel y la concentración de gelatina aumenta, los geles se vuelven mecánicamente blandos y contienen una mayor cantidad de restos de adhesión celular59. Nuestros resultados son consistentes con otros informes de que los hidrogeles altamente viscosos dan como resultado una menor viabilidad celular debido a la alta presión de extrusión, lo que imparte una mayor tensión de corte a las células56,60.

El ensayo MTT que se realizó en las muestras inmediatamente después de la impresión y después de 4, 7 y 11 días indica la tasa de viabilidad en las construcciones bioimpresas en 3D (Fig. 2E). La tasa de viabilidad, en comparación con el día 1, aumentó durante la semana, lo que confirma la accesibilidad de las células al oxígeno y los nutrientes. Las construcciones de hidrogel tenían suficiente porosidad y estructura de poros interconectados, lo que garantiza la difusión de nutrientes dentro de la construcción y proporciona un ambiente apropiado para las células vivas. Además, esta estructura porosa interconectada también permite la difusión de productos de desecho desde la construcción. El día 11, se observó que la absorbancia era 2,07 ± 0,06, lo que indica una caída en la tasa de proliferación celular pero muestra todavía una muy buena viabilidad celular. Parece que entre el día 7 y el día 11 las construcciones alcanzan la capacidad máxima para albergar células y algunas células comenzaron a morir. Estos hallazgos confirmaron una buena biocompatibilidad de las construcciones de hidrogel bioimpresas en 3D y mostraron su idoneidad para preservar las células viables durante un tiempo prolongado.

Para la fabricación de cocultivos mediante la bioimpresión de dos líneas celulares cancerosas diferentes, las células cancerosas MCF7 y MDA-MB-231 se tiñeron previamente respectivamente con marcadores verdes y rojos antes de imprimir. El procedimiento de impresión se realizó de dos maneras para producir dos arquitecturas diferentes, una que incluye dos capas separadas de celdas y la otra una mezcla aleatoria de dos celdas (que se muestra en la Fig. 4A, B). Se puede observar que se logró un buen control del posicionamiento de las células en la construcción 3D y las células se ubicaron de manera homogénea en la estructura en comparación con el cocultivo producido en un matraz de cultivo 2D (Fig. 3C-E).

Los modelos de tumor en chip se muestran más eficientes en la investigación del cáncer en comparación con otros modelos, debido a su capacidad para imitar las interacciones entre tejidos y la vascularización del tumor61. El desarrollo de estos modelos es un paso avanzado de la bioimpresión y proporciona pruebas de alto rendimiento, mejores simulaciones de microfluidos y, por lo tanto, se observan mejores correlaciones in vitro e in vivo. Como se indicó en la introducción, la diseminación metastásica de un tumor comienza con la adquisición de un fenotipo agresivo por parte de un subconjunto de células que les permite desprenderse del tumor primario y migrar hacia un órgano secundario. Generalmente, las actividades metastásicas del cáncer de mama aumentan con las interacciones célula-matriz, la estimulación mecánica y la interacción de las células cancerosas con los fibroblastos y las células inmunitarias3,62. Por lo tanto, para el desarrollo de actividad metástasis en el tumor 3D diseñado, se debe considerar el desarrollo de un tumor multicelular heterogéneo.

Se definieron varios subtipos de cáncer de mama, con diferentes tendencias a realizar metástasis en el hueso42. En este estudio, utilizamos el factor de crecimiento epitelial (EGF) como material quimioatrayente y observamos la migración celular en cocultivos de células cancerosas y células no tumorigénicas utilizando el dispositivo de microfluidos. Nuestros modelos de microfluidos 3D se han desarrollado para recapitular la heterogeneidad de TME mediante la introducción de un gradiente químico, y producimos una plataforma de modelado de cáncer mediante la combinación de un dispositivo de microfluidos y bioimpresión 3D por primera vez. Para validar el modelo, se incluyeron por separado líneas celulares de cáncer de mama maligno triple negativo (MDA-MB-231) y células epiteliales mamarias no tumorigénicas (MCF10A) en el modelo tumoral, todas las cuales mantuvieron una alta viabilidad durante todos los experimentos (datos no mostrados). aquí). Luego, tres arquitecturas tumorales diferentes de células MDA-MB-231 y MCF10A se bioimprimieron con las siguientes proporciones MDA-MB-231/MCF10A: 1/1 (S11), 1/4 (S14) y 4/1 (S41). y las muestras se colocaron en la cámara del dispositivo de microfluidos. Se selló la cámara y se produjo el gradiente químico de EGF durante 8 h. Se tomaron imágenes de las muestras antes y después de aplicar el flujo y realizar el gradiente de EGF. Comparamos la proporción de células MDA-MB-231 con respecto a células MCF10A en la parte superior del andamio que estuvo expuesta a la concentración más alta de EGF. MDA-MB-231 exhibió un comportamiento migratorio hacia EGF y se observó que muchas células se movían a la parte superior de la cámara donde la concentración de EGF era mayor (Fig. 4C-E, los segundos paneles). Sin embargo, las células circundantes MCF10A mostraron poca migración neta. El comportamiento migratorio fue diferente cuando las células MCF10A estaban presentes en el cocultivo, y la proporción de células cancerosas y células no cancerosas fue diferente. Observamos la tendencia de migración más alta cuando la proporción de células cancerosas con respecto a las células no cancerosas circundantes era de 1:1, como se muestra en la Fig. 4C. Cuando el MCF10A circundante es cuatro veces mayor que el de las células cancerosas MBA-MB-231, la migración es insignificante, y cuando las células cancerosas están cuatro veces más pobladas que las células circundantes, la tasa de migración también disminuye. Esto puede atribuirse a la competencia de las células MDA-MB-231 hacia el EGF y a la capacidad de acumulación del andamio.

La adhesión celular es uno de los factores importantes en la metástasis. La adhesión entre las células tumorales y sus células vecinas, especialmente los fibroblastos, ha sido investigada en las últimas dos décadas63,64. Se ha demostrado que los fibroblastos pueden actuar como células líder en metástasis proporcionando adhesión mecánica heterotípica a las células tumorales63,65. También se sabe que las moléculas de adhesión celular que pueden actuar como supresores de tumores están alteradas en el cáncer, por lo que las células cancerosas pueden perder estas moléculas de superficie66. Por lo tanto, el número relativo de células cancerosas y circundantes y la coordinación de las células sanas y cancerosas entre sí pueden desempeñar un papel importante en la metástasis.

Las investigaciones muestran que el cáncer metastásico ocurre en una fase más temprana del desarrollo del cáncer que se origina a partir de una célula que migra fuera de la mama, por ejemplo, antes de que el tumor primario se forme por completo67,68. Nuestros resultados sugieren que la migración máxima ocurre cuando el número de células cancerosas y no cancerosas en el microambiente es similar. Por lo tanto, cuando la cantidad de células cancerosas es mucho mayor que la de las células circundantes, la movilidad celular reduce la posibilidad debido a la mayor afinidad de las células cancerosas entre sí. Además, la interacción entre los dos tipos de células diferentes puede impedir la migración de las células tumorales hacia el exterior cuando las células sanas circundantes son mucho mayores en número. Esto concuerda con informes anteriores en los que los fibroblastos dictan la dirección de la migración65. Nuestro modelo basado en arquitectura para la migración de células cancerosas puede proporcionar en el futuro información importante para la predicción del tiempo de metástasis.

Implementamos con éxito un modelo de tumor en chip basado en la bioimpresión 3D de dos tipos diferentes de células de cáncer de mama y células epiteliales mamarias no tumorigénicas. Es fundamental comprender los mecanismos moleculares y celulares de la heterogeneidad tumoral para el desarrollo de resistencia al tratamiento. Dado que el cáncer de mama muestra heterogeneidad tanto en los tumores de mama in vivo como en las líneas celulares in vitro, la investigación de la heterogeneidad del tumor tiene implicaciones importantes para el diagnóstico, el tratamiento terapéutico y la comprensión de la quimiorresistencia. Incluso en un solo tumor de mama, pueden coexistir diferentes tipos de poblaciones de células cancerosas, lo que complica la correcta identificación de los subtipos de cáncer de mama. Además, muchos estudios muestran que la interacción entre células tumorales y las interacciones tumor-TME tienen una influencia significativa en la progresión e invasión del tumor. Nuestro modelo heterogéneo de tumor en chip puede tener un gran impacto en la investigación del tratamiento del cáncer. En este estudio, desarrollamos métodos de bioimpresión 3D para construir modelos in vitro de TME hechos de diferentes tipos de células cocultivadas con distribución y arquitectura controladas en una matriz de hidrogel. El tumor estaba representado por una construcción de hidrogel de cocultivo cargado de células cancerosas y no cancerosas, mientras que su microambiente se modeló en un chip de microfluidos capaz de producir un gradiente químico. Investigamos un hidrogel compuesto como biotinta, compuesto de alginato y gelatina, y se utilizó una biotinta optimizada para la bioimpresión de las construcciones cocultivadas. La morfología y distribución de dos tipos de células cancerosas, MCF7 y MDA-MB-231, se investigaron mediante bioimpresión secuencial y bioimpresión mixta con biotinta para mostrar la precisión de la ubicación de las células después de la impresión. El gradiente del factor de crecimiento epitelial (EGF) se utilizó como estimulante para estudiar la migración celular en un formato estructural y de composición 3D diferente, incluidos sistemas de cocultivo mixto de células epiteliales mamarias no tumorigénicas, MCF10A y células cancerosas malignas MDA-MB-231. La Figura 5 muestra el resumen de nuestro modelo de cáncer en chip propuesto.

El resumen del modelo de cáncer en chip propuesto.

Una mejor comprensión de la relación entre la heterogeneidad intratumoral y la respuesta tumoral a la terapia abrirá nuevas puertas para el desarrollo de nuevos fármacos y el uso de compuestos ya aprobados en nuevos esquemas de tratamiento o combinaciones para terapias personalizadas más efectivas. Nuestro modelo de tumor en chip puede facilitar la comprensión del comportamiento de las células cancerosas en tumores heterogéneos y su microambiente.

Todos los datos y materiales están disponibles previa solicitud. Comuníquese con el autor correspondiente [email protected].

Microambiente tumoral

Bidimensional

Tridimensional

La matriz extracelular

Factor de crecimiento epitelial

Dimetilsulfóxido

Medio de Eagle modificado por Dulbecco

Bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2H-tetrazolio

Suero bovino fetal

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Se agradece el apoyo financiero de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) (***).

Departamento de Matemáticas Aplicadas, Universidad de Waterloo, Waterloo, Canadá

Nafiseh Moghimi, Altay Burak Dalan, Dorsa Mohammadrezaei y Mohammad Kohandel

Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Nafiseh Moghimi y Aaron Goldman

Departamento de Ingeniería Eléctrica, Universidad de Waterloo, Waterloo, Canadá

Seed Ali Hosseini

Departamento de Genética Médica, Facultad de Medicina, Universidad de Yeditepe, Estambul, Turquía

Altay Burak Dalan

División de Ingeniería en Medicina, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA, EE. UU.

Aarón Goldman

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NM diseñó los experimentos, analizó los datos y escribió el manuscrito. SAH diseñó el dispositivo de microfluidos y las simulaciones relevantes. DM ayudó en experimentos de cultivo celular. ABD ayudó en experimentos de cultivo celular, análisis de datos e interpretación de los resultados experimentales. AG y MK supervisaron la investigación. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final. Todos los autores leyeron el manuscrito y aceptaron publicarlo en Biomaterials Research.

Correspondencia a Nafiseh Moghimi.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en conflicto ni relaciones personales conocidas que pudieran haber influido en el trabajo presentado en este artículo.

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Reimpresiones y permisos

Moghimi, N., Hosseini, SA, Dalan, AB et al. Heterogeneidad tumoral controlada en un sistema de cocultivo mediante un modelo de tumor en chip bioimpreso en 3D. Informe científico 13, 13648 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40680-x

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Recibido: 16 de mayo de 2023

Aceptado: 16 de agosto de 2023

Publicado: 22 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40680-x

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