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Jun 25, 2023

Actividad antimicrobiana de Lacticaseibacillus rhamnosus CRL 2244 y su impacto en las respuestas fenotípicas y transcripcionales en Acinetobacter baumannii resistente a carbapenémicos.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14323 (2023) Citar este artículo Detalles métricos El Acinetobacter baumannii (CRAB) resistente a los carbapenémicos es un patógeno nosocomial reconocido con efectos limitados

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14323 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

Acinetobacter baumannii (CRAB) resistente a carbapenémicos es un patógeno nosocomial reconocido con opciones limitadas de tratamiento con antibióticos. Las bacterias ácido lácticas (BAL) constituyen una alternativa terapéutica prometedora. Aquí estudiamos las propiedades antibacterianas de una colección de cepas de BAL mediante análisis fenotípico y transcriptómico contra cepas clínicas de A. baumannii. Una cepa, Lacticaseibacillus rhamnosus CRL 2244, demostró una potente capacidad inhibidora de A. baumannii con una importante actividad letal. Las imágenes de microscopía electrónica de barrido mostraron cambios en la morfología de A. baumannii con una mayor formación de vesículas de la membrana externa. También se observaron cambios significativos en los niveles de expresión de una amplia variedad de genes. Curiosamente, la mayoría de los genes modificados estaban implicados en una vía metabólica que se sabe está asociada con la supervivencia de A. baumannii. El operón paa, el sistema Hut y la degradación de ácidos grasos fueron algunas de las vías que se indujeron. El análisis revela el impacto de Lcb. rhamnosus CRL 2244 sobre la respuesta de A. baumannii, lo que resulta en estrés bacteriano y posterior muerte celular. Estos hallazgos resaltan las propiedades antibacterianas de Lcb. rhamnosus CRL 2244 y su potencial como estrategia alternativa o complementaria para el tratamiento de infecciones. Una mayor exploración y desarrollo de LAB como opción de tratamiento podría proporcionar alternativas valiosas para combatir las infecciones por CRAB.

Acinetobacter baumannii (CRAB) resistente a carbapenems ha ganado notoriedad en los últimos años debido a su rápida aparición nosocomial y su propagación global. CRAB causa infecciones graves en pacientes vulnerables y también se sabe que coloniza el recto de pacientes y trabajadores asociados con unidades de cuidados intensivos1,2,3. Las cepas CRAB circulantes poseen una resistencia extrema a los antibióticos (XDR) y, en algunos casos, pan-resistencia a los medicamentos (PDR)4, lo que complica gravemente la terapia con los antibióticos actualmente disponibles. En la última década, y a pesar de numerosos esfuerzos por encontrar alternativas terapéuticas, la producción de nuevos fármacos para el tratamiento de las infecciones causadas por CRAB ha sido escasa.

Las bacterias ácido lácticas (BAL) constituyen una alternativa terapéutica prometedora debido a la capacidad demostrada de ciertas cepas de BAL para inhibir patógenos del grupo ESKAPE (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Enterococcus faecalis)5,6,7 ,8,9. Las BAL son microorganismos Gram positivos considerados seguros para su inclusión en alimentos (GRAS) y se utilizan ampliamente en la producción de diversos alimentos fermentados, donde aportan sabor y textura del producto final10,11. Las BAL están ampliamente distribuidas en la naturaleza y muchas de ellas se encuentran como parte de la microbiota intestinal de humanos y animales. Cepas de diferentes especies de BAL se utilizan como suplementos probióticos por sus propiedades beneficiosas para la salud humana o animal. Estos beneficios van desde mejorar la salud intestinal y la respuesta inmune12, hasta prevenir la diarrea aguda y asociada a antibióticos13 y la gastritis crónica14,15, entre otros. El efecto antimicrobiano de las BAL contra patógenos constituye una propiedad importante en la selección de probióticos potenciales para el mantenimiento del equilibrio microbiano intestinal y como sustituto de los antibióticos sintéticos16. Las BAL probióticas son antagonistas de los patógenos e inhiben el crecimiento de estas bacterias al (i) producir sustancias antimicrobianas o compuestos bioactivos7,8,9,17; (ii) ocupando sus nichos y/o desplazándolos (incluso en la prevención y/o eliminación de biopelículas)5; (iii) promoviendo la maduración y la integridad intestinal y aumentando el efecto de barrera no inmunodependiente; o activando directamente las células linfoides, en parte mediada por el tejido linfoide asociado al intestino (sistema GALT), y (iv) modulando las respuestas inmunes locales y sistémicas6,18,19.

Se ha descrito la actividad antimicrobiana de ciertas BAL y/o sus productos extracelulares contra A. baumannii20. En un modelo murino de infección respiratoria, demostraron que Streptococcus constellatus, frecuentemente aislado de la cavidad bucal, potencia la respuesta inmune de los ratones al promover la proliferación de linfocitos citotóxicos que eliminan A. baumannii. Stanbro et al.19 demostraron que la aplicación tópica de ciertos productos de Lcb. acidophilus ATCC 4356 y L. reuteri ATCC 23272 fueron efectivos en la resolución de heridas causadas por A. baumannii. Además, estudios in vitro demostraron la actividad antagonista de diferentes cepas de BAL como L. animalis LMEM6, L. plantarum LMEM7, L. acidophilus LMEM8, Lcb. rhamnosus LMEM9, Lcb. casei Shirota, L. plantarum LJ1R3 y L. gasseri LBM220 contra aislados clínicos de A. baumannii MDR5,8,21,22. Si bien existe evidencia de que las BAL ejercen un efecto antagónico contra A. baumannii, la respuesta específica de A. baumannii y el impacto de las BAL en su supervivencia, virulencia y persistencia no se han examinado a fondo. El objetivo de este estudio es abordar la brecha de conocimiento sobre la respuesta de A. baumannii al efecto antagónico de LAB e investigar cómo la presencia de LAB afecta el comportamiento de A. baumannii proporcionando conocimientos que pueden contribuir a estrategias para el control de infecciones nosocomiales. Aquí, evaluaremos varios aspectos del comportamiento de A. baumannii, incluida su tasa de crecimiento, formación de biopelículas, susceptibilidad a los antibióticos y expresión de genes asociados a la virulencia.

Inicialmente evaluamos la actividad inhibidora de diez especies diferentes de BAL en la cepa representativa susceptible a los antibióticos A. baumannii A118 mediante una capa de agar probando el cultivo nocturno, el sedimento recolectado y el sobrenadante de las BAL. En los ensayos de interacción bacteriana en medio sólido, la mayoría de las cepas analizadas mostraron una capacidad inhibidora baja o ausente en A118 (Tabla 1). Sin embargo, se observó una fuerte actividad de inhibición definida como "alto valor R" alrededor del cultivo y el sedimento de Lcb. rhamnosus CRL 2244 (7 y 7,5, respectivamente) (Tabla 1). El efecto antagónico representado como unidades arbitrarias/ml alcanzó 1600 y 1650 para el cultivo y el sedimento de Lcb. rhamnosus CRL 2244, respectivamente (Tabla 1). En particular, también se observaron los mismos halos de inhibición "fuertes" en A118 cuando se sembraron diluciones en serie de un cultivo nocturno de CRL 2244 en un césped de 108 UFC de la cepa modelo indicadora A118 (Fig. 1A). ).

Efecto inhibidor de Lcb. rhamnosus CRL 2244 en cepas clínicas de A. baumannii. (A) Actividad inhibidora de A. baumannii A118 (AB). La placa de dilución 10–5 muestra el césped AB completamente inhibido, mientras que la placa de dilución 10–6 muestra los halos de inhibición alrededor de las colonias CRL 2244. (B) Actividad antimicrobiana del cultivo (C), sedimento (P) y sobrenadante celular (S) de Lcb. rhamnosus CRL 2244 en cepas de A. baumannii resistentes a carbapenémicos a las 16 h de incubación.

Por tanto, Lcb. rhamnosus CRL 2244 fue seleccionado para evaluar su actividad antimicrobiana mediante superposición de agar contra cepas CRAB de diferentes complejos clonales, que albergan diferentes tipos de carbapenemasas y con resistencia extrema a los antibióticos (XDR). Además, una cepa probiótica modelo comúnmente utilizada para tratar o prevenir la diarrea, Lcb. rhamnosus ATCC 53103 (GG), se incluyó. CRL 2244, en las condiciones ensayadas, inhibió las cepas AB5075 (cepa hipervirulenta), AMA16, AB0057, ABUH702 y AYE, con diámetros de halo de inhibición "fuertes" (DHI > 20 mm); sin embargo, la inhibición de la cepa ABUH702 fue débil (DHI <10 mm) (Fig. 1B). La cepa ATCC 53103, en las condiciones ensayadas, no mostró actividad antimicrobiana sobre ninguna de las cepas CRAB evaluadas (datos no mostrados).

Evaluar la actividad letal de Lcb. rhamnosus CRL 2244, evaluamos la viabilidad de AB5075 y A118 24 h después de la coincubación de células con CRL 2244. Se utilizaron ambas células en una proporción de 1:1 y en fase estacionaria (sin la adición de medio fresco). En ambos casos se observó muerte celular total con una tasa de supervivencia inferior a 1 × 10–9 y inferior a 1 × 10–8 para AB5075 y A118, respectivamente.

Para evaluar el efecto de eliminación del tiempo a lo largo del tiempo, se cocultivó un ciclo de 24 h de AB5075 con Lcb. rhamnosus CRL2244 con o sin adición de medio fresco se evaluó y se registraron UFC/ml en diferentes puntos temporales (Fig. 2). Las células AB5075 se combinaron con Lcb. rhamnosus CRL 2244 en una proporción de cultivos 1:1 con DO 600 nm = 0,1. En ausencia de medio fresco, se observó la muerte celular de AB5075 en un tiempo de contacto corto entre células de 4 h (Fig. 2A). Por el contrario, cuando se agregó medio BHI fresco, se observó una disminución de las UFC después de seis horas con una muerte celular total después de 24 h de incubación (Fig. 2B).

Actividad letal de Lcb. rhamnosus CRL 2244 en A. baumannii AB5075. (A) Las células crecieron durante la noche y se combinaron en una proporción de 1:1 (B) Cultivos nocturnos de ambas células en una proporción de 1:1 con la adición de medio fresco. Ambas condiciones se incubaron a 37 °C durante 24 h y se determinaron UFC/mL en diferentes tiempos de incubación durante un período de 24 h. Todos los ensayos se llevaron a cabo por duplicado. La significación estadística (P <0,05) se determinó mediante ANOVA de dos factores seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. La importancia del cocultivo frente a CRL2244 y del cocultivo frente a AB5075 se indicó mediante: * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 y **** P < 0,0001.

Susceptibilidad a los antibióticos de AB5075 y A118 cocultivados con Lcb. rhamnosus CRL 2244 durante 4 h con adición en medio fresco se evaluó mediante difusión en disco y difusión en gradiente. El perfil de susceptibilidad a los antibióticos de las cepas A118 y AB5075 en presencia de CRL 2244 fue similar al de las cepas no expuestas en las condiciones analizadas (datos no mostrados).

Se realizó un análisis SEM para estudiar si A. baumannii experimenta cambios a nivel morfológico en presencia de Lcb. rhamnosus CRL 2244. Las imágenes microscópicas muestran que las células de A. baumannii en ausencia de Lcb. rhamnosus CRL 2244 (control) tienen forma cocobacilar, tamaño uniforme con aproximadamente 600 a 700 nm de longitud, tienen una superficie rugosa y están distribuidos homogéneamente e inmersos en una matriz extracelular o biopelícula (Fig. 3). Cuando A. baumannii estuvo expuesta a Lcb. rhamnosus CRL 2244, se observaron cambios en la superficie bacteriana, el tamaño celular y la distribución. Si bien la superficie sigue siendo rugosa, la formación de nanotubos y vesículas de membrana externa (OMV) aumentó significativamente en comparación con las células de control cultivadas en ausencia de Lcb. rhamnosus CRL 2244 (Fig. 3). El tamaño de las células es variable, algunas conservan su forma mientras que otras muestran un aumento en longitud (tamaños de aproximadamente 1000 nm) (Fig. 3). Además, se observa que las células de A. baumannii se distribuyen formando conglomerados tridimensionales multicelulares alrededor de Lcb. rhamnosus CRL 2244 cadenas (Fig. 3). Cambios en la morfología de Lcb. rhamnosus CRL2244 al interactuar con A118 no se observaron.

Microscopía electrónica de barrido de células de A. baumannii en presencia de Lcb. rhamnosus CRL 2244. Se utilizaron cultivos de células de A. baumannii como control. Las micrografías se capturaron con un aumento de ×10.000 o ×20.000. Barras, 200 nm. La flecha blanca apunta a una vesícula de membrana externa (OMV) representativa.

Investigar la respuesta transcripcional de A. baumannii cuando se expone a Lcb. rhamnosus CRL 2244, se realizaron análisis de secuencia de ARN y RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR).

Análisis transcriptómico de secuencia de ARN de A. baumannii AB5075 expuesto a Lcb. rhamnosus CRL 2244, reveló 386 genes expresados ​​diferencialmente (DEG) utilizando un valor de P ajustado < 0,05 y un límite de cambio de log2 > 1. Estos DEG representan el 10,19 % del total de genes en el genoma de referencia AB5075 y abarcan una amplia gama de categorías funcionales. Entre los DEG, 223 estaban regulados al alza y 163 a la baja. En particular, estos DEG incluyen genes asociados con varias funciones importantes, como la absorción de hierro, la resistencia a los antibióticos, el metabolismo, la síntesis de la pared celular, la virulencia, los reguladores transcripcionales, las bombas de eflujo y la motilidad, entre otros (Tabla S2).

En particular, hay un aumento en la expresión de genes involucrados en procesos metabólicos, como el catabolismo de compuestos orgánicos, aminoácidos, ácidos grasos y carbohidratos (Tabla S2, Figs. 4 y S1). Los genes que se sabe que tienen un impacto en la patobiología de A. baumannii y que desempeñan un papel en la virulencia, la evasión inmunitaria, la infección y la resistencia a los antibióticos23, como el operón paa, se expresan diferencialmente en condiciones de cocultivo (Fig. 4A y B). . El catabolismo del PAA implica la producción de succinil-CoA y acetil-CoA, que luego participan en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA); Existe expresión diferencial de genes que codifican diferentes enzimas liasa, ligasa, transferasa y oxidorreductasa asociadas con estas vías (Tabla S2 y Fig. 4A y B). Además, también se encontró que los genes del sistema Hut (hutG, hutU, hutH) implicados en el catabolismo de la histidina utilizando carbono y nitrógeno como fuente estaban regulados positivamente (Fig. 4C y D). Este sistema ha sido identificado como importante para la infección por A. baumannii24. Otros genes que se encontraron regulados positivamente fueron los implicados en el catabolismo de acetoína/butanodiol (acoA, acoB, acoC, acoD, acoN y acoR), el metabolismo de los benzoatos (benA, benB, benC, benD, benK y benP2) y genes asociados. con metabolismo del alcohol (Fig. 4E y F, Tabla S2 y Fig. S1).

Resultados transcripcionales de AB5075 de vías metabólicas representativas afectadas por Lcb. rhamnosus CRL 2244. (A) Mapa de calor que describe la expresión diferencial de genes implicados en la vía catabólica del ácido fenilacético. Los asteriscos representan un valor de P <0,05. (B) qRT-PCR de paaA, paaB y paaE de AB5075 crecieron en BHI o en cocultivo con Lcb. rhamnosus CRL 2244. (C) Mapa de calor que describe la expresión de genes diferenciales de los genes codificadores del sistema Hut implicados en el metabolismo de la histidina. Los asteriscos representan un valor de P <0,05. (D) qRT-PCR de hutC, hutD, hutG, hutH, hutI, hutT y hutU de AB5057 crecieron en BHI o en cocultivo con Lcb. rhamnosus CRL 2244. (E) Mapa de calor que representa los genes de expresión diferencial de genes implicados en el metabolismo de la acetoína. Los asteriscos representan un valor de P <0,05. (F) qRT-PCR de acoA, acoB, acoC y acoR de AB5057 crecieron en BHI o en cocultivo con Lcb. rhamnosus CRL 2244. Para los ensayos qRT-PCR se utilizaron tres muestras independientes. La significación estadística (P < 0,05) se determinó mediante ANOVA de dos factores seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey, un asterisco: P < 0,05; dos asteriscos: P <0,01 y tres asteriscos: P <0,001.

En cuanto a los cambios en la expresión de genes implicados en el metabolismo de los ácidos grasos, se observó un aumento en la expresión de 34 genes en presencia de Lcb. rhamnosus CRL 2244. LipA, que es esencial para la utilización de ácidos grasos de cadena larga, la colonización y la persistencia en la infección por A. baumannii, se encontraba entre los DEG observados (Tabla S2 y Fig. S1).

Se observó una regulación negativa en la expresión de genes relacionados con los sistemas de secreción, la biopelícula y el metabolismo del hierro, mientras que se observó una regulación positiva en los genes asociados a la resistencia a los antibióticos (Fig. 5A-E y Tabla S2). Cultivos nocturnos de AB5075, Lcb. rhamnosus CRL 2244 y AB5075 combinados con Lcb. rhamnosus CRL 2244 durante 24 h para evaluar la formación de biopelículas. Se observó una disminución estadísticamente significativa en la producción de biopelículas cuando se cocultivó AB5075 con Lcb. rhamnosus CRL 2244 (Fig. S2). Se observó un aumento en la expresión de genes relacionados con las bombas de expulsión y la resistencia a los antibióticos (Fig. 5D-E). Los genes seleccionados se evaluaron mediante ensayos qRT-PCR, que no revelaron cambios estadísticamente significativos ni mostraron resultados que estuvieran de acuerdo o en desacuerdo con los datos de RNA-seq (Fig. S3). Por último, se encontró que los genes que codifican las proteínas LrgB y CidA/LgrA estaban significativamente sobreexpresados ​​(Tabla S2). Estas proteínas afectan la fuerza motriz de los protones de la membrana e inducen la muerte celular programada en las bacterias25. Además, se ha identificado que estos genes están implicados en el sistema de absorción de piruvato en Streptococcus mutans y su papel en la conexión entre la muerte celular y las vías metabólicas clave26.

Mapa de calor que representa la expresión diferencial de genes implicados en la virulencia y la resistencia a los antibióticos. Los asteriscos representan un valor de P <0,05. (A) Sistemas de secreción tipo 6, (B) Biopelícula, (C) Hierro, (D) Bombas de eflujo y (E) resistencia a los antibióticos.

La actividad antagonista de Lcb. rhamnosus CRL 2244 en AB5075 se evaluó en un medio complejo de microorganismos, como materia fecal humana. Para ello se utilizó materia fecal humana obtenida comercialmente de un donante sano. Lcb. rhamnosus CRL 2244 también afectó la viabilidad de AB5075 en presencia de una microbiota comensal. Se observó una disminución del 35 % en la viabilidad de AB5075 en el cocultivo con Lcb. rhamnosus CRL 2244 en relación con el control AB5075 (1,3 × 108 frente a 2,0 × 108 UFC/ml). Sin embargo, no se observaron cambios en los fenotipos de las células AB5075 supervivientes (perfil de motilidad y susceptibilidad a los antibióticos). Además, Lcb. rhamnosus CRL 2244 redujo la carga microbiana total de la materia fecal humana hasta en un 50 % (2,0 × 108 frente a 4,0 × 108 UFC/mL de control fecal humano) y fue capaz de inhibir la población de E. coli presente en la muestra fecal humana ( datos no mostrados).

Las BAL tienen una larga historia de uso seguro en alimentos, donde imparten las propiedades tecnológicas y nutricionales deseadas a los productos fermentados. Además, determinadas especies ejercen efectos beneficiosos sobre la salud del huésped. El efecto antagónico o antimicrobiano de las BAL contra patógenos ha sido bien documentado en la literatura5,9. Sin embargo, los estudios sobre la actividad antimicrobiana de las BAL y/o sus productos extracelulares contra A. baumannii son actualmente limitados7,9,27. En el presente trabajo observamos una fuerte actividad inhibidora de las LAB Lcb. rhamnosus CRL 2244 en cepas de A. baumannii susceptibles y resistentes a carbapenémicos. Lcb. rhamnosus CRL 2244 ejerce un efecto letal en células de A. baumannii tanto en fase exponencial como estacionaria. Sin embargo, el sobrenadante derivado de un cultivo de 24 h de Lcb. rhamnosus CRL 2244 no mostró actividad antimicrobiana en las condiciones evaluadas. Sigue siendo plausible que la concentración del metabolito activo fuera baja en el medio analizado. Sin embargo, la posibilidad de que los metabolitos liberados por Lcb. rhamnosus CRL 2244 en el medio ambiente podría ejercer un efecto requiere más estudios.

Además, la morfología de las células de A. baumannii mostró alteraciones cuando se expusieron a Lcb. rhamnosus CRL 2244. Estos cambios incluyeron variaciones en el tamaño, la distribución y la cantidad de OMV liberados por A. baumannii, lo que indica una posible respuesta defensiva y sugiere que las células de A. baumannii pueden estar experimentando estrés. Ladha et al.7, han demostrado que un compuesto puro producido por Lactiplantibacillus plantarum LJR13 produjo poros en la superficie de Listeria monocytogenes, S. aureus y A. baumannii afectando la superficie bacteriana7. Estudios anteriores han demostrado que la exposición de las células de A. baumannii al ácido láctico y al ácido acético producido por Lcb. rhamnosus puede provocar la alteración o desintegración de la envoltura celular de A. baumannii. Además, estos autores observaron la aparición de estructuras similares a filamentos, que pueden servir como sitios para la fuga excesiva de contenidos citoplasmáticos vitales27.

A través de nuestro análisis transcriptómico del cocultivo de células de A. baumannii con Lcb. rhamnosus CRL 2244, observamos que la expresión de varios genes está significativamente alterada. Curiosamente, la mayoría de los genes expresados ​​diferencialmente (DEG) están asociados con vías metabólicas, lo que indica que A. baumannii está respondiendo activamente al estrés impuesto por las LAB para mejorar sus estrategias de supervivencia. La vía catabólica del ácido orgánico fenilacetato (PAA), que desempeña un papel crucial en diversos procesos biológicos, se encuentra entre las vías metabólicas que se han encontrado alteradas. El catabolismo del PAA se ha asociado con evasión inmune, colonización, persistencia, formación de biopelículas, estrés oxidativo y resistencia a los antibióticos28,29,30,31. Curiosamente, la expresión de genes dentro del operón paa está influenciada por diferentes condiciones ambientales, incluida la exposición al líquido pleural humano, mucina y antibióticos, lo que destaca cómo A. baumannii emplea diversas estrategias para superar el estrés ambiental. El aumento de la expresión del operón paa se ha relacionado con la represión de los pili CSU, lo que lleva a una disminución de la formación de biopelículas28. Nuestros datos de RNA-seq y ensayos de formación de biopelículas concuerdan con este estudio. En nuestro estudio, observamos la regulación positiva de los genes pertenecientes al sistema Hut, reconocido por permitir la utilización de histidina durante la infección. Este hallazgo refuerza aún más la adaptabilidad metabólica de A. baumannii, que es crucial para su supervivencia en el entorno del huésped. El metabolismo de los ácidos grasos aumenta fuertemente en presencia de bacterias LAB. Informes anteriores han demostrado que los ácidos grasos del huésped tienen una propiedad antimicrobiana durante la infección32,33,34. Otros autores demostraron que la β-oxidación de A. baumannii puede metabolizar los ácidos grasos tóxicos permitiendo que A. baumannii resista durante la infección32,33,34. También se ha informado que esta especie puede utilizar ácidos grasos como fuente de energía o sustrato para la biosíntesis de membrana35. Rodman et al.36 observaron que cuando A. baumannii se expone al líquido pleural humano o a proteínas humanas, como la HSA, se produce un aumento en la expresión de genes asociados con el metabolismo de los ácidos grasos36. El análisis exhaustivo de los datos transcriptómicos destaca que en presencia de Lcb. rhamnosus CRL 2244, A. baumannii exhibe una adaptabilidad metabólica notable y versátil como respuesta directa al estrés impuesto por las BAL. Esta adaptabilidad indica que A. baumannii posee la capacidad de ajustar dinámicamente sus vías metabólicas para responder a los desafíos presentados por la presencia de Lcb. rhamnosus CRL 2244. Esta adaptabilidad probablemente sea crucial para la supervivencia y persistencia de A. baumannii frente a factores estresantes ambientales.

Otro hallazgo notable en la respuesta transcripcional de A. baumannii es la sobreexpresión significativa de los genes cidAllrgA y lrgB. Estos genes han sido implicados en la muerte celular programada y previamente se han asociado con respuestas celulares durante el metabolismo de desbordamiento37. Según nuestros datos, sugerimos que la presencia de Lcb. rhamnosus CRL 2244 puede inducir estrés y posible muerte celular en A. baumannii, probablemente debido a la mayor actividad metabólica observada en estas condiciones. Esta observación se alinea con el fenómeno documentado de que A. baumannii experimenta muerte celular después de 24 h en presencia de Lcb. rhamnosus CRL 2244.

Trabajos anteriores han demostrado que las BAL probióticas ejercen su actividad antimicrobiana liberando metabolitos, como compuestos orgánicos o ácidos tetrámicos como la reutericiclina38, o formando coagregaciones multicelulares, entre otros. Se ha sugerido que la coagregación celular, como hemos observado mediante SEM, permitiría la colonización de los tejidos por bacterias lácticas beneficiosas, alterando así la adherencia del patógeno39. Considerando trabajos publicados previamente y los datos recopilados en este manuscrito, podemos sugerir que cuando A. baumannii se expone a Lcb. rhamnosus CRL 2244, un cambio significativo a nivel metabólico puede conducir potencialmente a la muerte celular. Los estudios futuros se centrarán en el aislamiento, caracterización y evaluación biológica de Lcb. rhamnosus CRL 2244 metabolitos para identificar mecanismos de acción específicos que podrían conducir a nuevas terapias. Según la literatura anterior, un lugar potencial para utilizar la Lcb. rhamnosus CRL 2244 o su(s) compuesto(s) activo(s) pueden administrarse tópicamente para tratar infecciones de heridas40,41,42.

Los resultados presentados en este estudio mostraron que Lcb. rhamnosus CRL 2244 exhibe anti-A. efecto baumannii. Además, la capacidad observada de las LAB para inducir una respuesta transcriptómica amplia en A. baumannii resalta las complejas interacciones entre estos organismos. Este trabajo proporciona una base para futuras investigaciones destinadas a dilucidar los mecanismos subyacentes involucrados y el potencial de Lcb. rhamnosus CRL 2244 se utilizará para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para combatir las infecciones por A. baumannii.

Se utilizaron diez cepas de bacterias del ácido láctico (BAL) para evaluar su actividad antimicrobiana contra A. baumannii. Las cepas incluidas fueron la cepa probiótica modelo Lacticaseibacillus rhamnosus ATCC 53103; y cepas con propiedades tecnológicas y/o funcionales de interés43,44,45,46,47,48, pertenecientes a la colección de cultivos CERELA (CRL) o a la colección del laboratorio como Latilactobacillus curvatus CRL705, Limosilactobacillus mucosae CRL573, Lactobacillus acidophilus CRL641, Fructobacillus tropaeolis CRL2034, Limosilactobacillus reuteri CRL1101, Companilactobacillus farciminis CRL748, Lacticaseibacillus rhamnosus CRL75, CRL 2244 y Principia (Tabla S1). Las cepas se subcultivaron a la temperatura óptima para cada una dos veces en caldo Man, Rogosa y Sharpe (MRS) (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, Reino Unido) antes de su uso experimental.

En este trabajo se utilizaron dos cepas modelo de A. baumannii, la cepa A118 sensible a los antibióticos49 y la CRAB AB5075 (blaOXA-23 y blaOXA-51,50). Además, cuatro cepas clínicas CRAB adicionales que pertenecen a diferentes complejos clonales y que albergan diferentes tipos de carbapenemasas como AMA16 (blaNDM-1 y blaPER-7,51), AB0057 (blaTEM-1, blaOXA-23, blaADC,52), ABUH702 (ISAba1 /OXA-6653) y AYE (blaVEB-1, blaOXA-6954). Las cepas se cultivaron a 37 °C en caldo BHI (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, Reino Unido) con agitación.

La actividad antagonista o inhibidora de las BAL contra las diferentes cepas indicadoras de A. baumannii se determinó mediante el método de superposición de agar blando5. Brevemente, se inocularon manchas (105 UFC/spot) de cultivo (C), sobrenadante (S) y sedimento (P) (S y P obtenidos centrifugando el cultivo a 10.000 rpm durante 5 min) de diferentes LAB en placas de agar MRS. utilizando un cultivo en caldo MRS (cultivado a 37° o 30 °C durante 24 h), y se dejó secar durante 30 min. Luego se cubrieron con agar blando Muller-Hinton (MH) (agar al 0,8%) premezclado con 108 UFC de cepas indicadoras de A. baumannii y se incubaron a 37 °C durante 24 h. El diámetro del halo de inhibición del crecimiento (IHD) de A. baumannii se midió e interpretó según Shokryazdan et al.55: el IHD > 20 mm (Strong); 20 a 10 mm (intermedio); y < 10 mm (débil). El ancho de la zona clara o valor "R" también se determinó según la fórmula R = Diámetro de inhibición—Diámetro del punto dividido por dos5; y se interpretará como "sin capacidad de inhibición" cuando R < 2 mm, "baja inhibición" con valores de "R" de 2 a 5 mm y "alta capacidad de inhibición" con valores de "R" > 6 mm56,57. AU/ml (unidades arbitrarias por ml) se calculó como IHD × 1000 dividido por µl de semilla5. Los ensayos se realizaron por triplicado.

La viabilidad de A. baumannii AB5075 y A118 en cocultivo con Lcb. rhamnosus CRL 2244 se evaluó a) combinando cultivos ON de ambas células (proporción 1:1 de cultivos con DO 600 nm = 0,1) sin adición de medio fresco y b) combinando una proporción 1:1 de cultivos con DO 600 nm con adición de medio BHI fresco, incubado a 37 °C durante 24 h. Se utilizaron como controles cultivos independientes de A. baumannii y CRL 2244. Se determinaron UFC/mL en diferentes tiempos de incubación mediante diluciones decimales y se sembraron en medio CLDE (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) con y sin la adición de eritromicina (2 μg/mL) para matar Lcb. rhamnosus CRL 2244. La significación estadística (P <0,05) se determinó mediante ANOVA de dos factores seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey, utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.).

La susceptibilidad a los antibióticos de AB5075 cocultivado con CRL 2244 durante 4 h se evaluó mediante difusión en disco y difusión en gradiente (concentración inhibidora mínima) siguiendo los procedimientos recomendados por el Clinical and Laboratory Standards Institute58. Discos antimicrobianos comerciales (Liofilchem ​​Srl, Italia) de 30 μg de cefepima (FEP), 30 μg de ceftazidima (CAZ), 10 μg de imipenem (IMP), 10 μg de meropenem (MER), 30 μg de cefiderocol (FDC), amikacina (AK), se utilizaron 5 μg de ciprofloxacina (CIP) y las placas se incubaron a 37 °C durante 18 h. MTS (Liofilchem ​​Srl, Italia) realizó las CIM para cefiderocol (FDC) y tetraciclina (TE) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los ensayos se realizaron por triplicado.

De cultivos nocturnos de A118 en caldo BHI (incubado a 37 °C con agitación) y CRL2244 en caldo MRS (incubado a 37 °C), se combinaron 500 µl de cada uno (cocultivo) y se incubaron a 37 °C sin agitación durante 1h 30min. Los controles incluyeron cultivos individuales de ambas células. Luego las muestras se centrifugaron a 500 rpm durante 2 min. Al sedimento recogido, se añadió y se homogeneizó 1 ml de fijador Karnovsky pH 7,2 (paraformaldehído al 2,66 %, tampón fosfato de sodio 0,1 M y glutaraldehído al 1,66 %). Luego, se colocaron 100 μL sobre la superficie de un cubreobjetos de vidrio de 10 mm de diámetro, se dejaron secar durante una hora y se deshidrataron utilizando una batería de soluciones alcohólicas de gradación creciente 30, 50, 70, 90, 100° y acetona durante 10 min cada una. . Después de la acetona, el secado en el punto crítico se realizó en un equipo de vacío Denton modelo DCP-1. Los vidrios se montaron sobre un soporte de aluminio (stub) y se adhirieron mediante una cinta conductora de carbón de doble cara. Luego se recubrieron con oro en un dispositivo de pulverización iónica JEOL modelo JFC-1100. La observación con microscopía electrónica se realizó con el Microscopio Electrónico de Barrido ZeissSupra 55VP (Alemania) perteneciente al Centro Integral de Microscopia Electrónica (CIME-CONICET- Universidad Nacional de Tucumán).

Se centrifugaron cultivos nocturnos de A. baumannii AB5075 y CRL 2244 con DO ajustada a 600 nm a 4,0 y se resuspendieron en 3 ml de caldo BHI y se incubaron durante 90 minutos a 37 °C. Las extracciones de ARN total se realizaron en tres réplicas biológicas para cada condición (AB5075 combinado con CRL 2244 y AB5075) utilizando el kit Direct-zol RNA (Zymo Research). Después de verificar la ausencia de contaminación del ADN, se subcontrató a Novogene Corporation (CA) para realizar el análisis de secuencia de ARNm, que incluyó el agotamiento del ARNr, la preparación de la biblioteca siguiendo los protocolos del kit de preparación de biblioteca direccional de ARN NEBNext Ultra II para Illumina (New England Biolabs) y Secuenciación de 150 pb de extremo pareado de Illumina NovaSeq 6000. Las lecturas de RNA-seq (acceso GEO GSE236782) correspondientes a A. baumannii AB5075 expuesto a CRL 2244 se analizaron de la siguiente manera. En primer lugar, se utilizó Trimmomatic v0.39 para recortar bases de baja calidad en los extremos de las lecturas a una longitud mínima de 100 pb y eliminar secuencias de adaptadores de Illumina. Luego, se utilizó FastQC (www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) para evaluar la calidad de las lecturas antes y después del recorte. Las lecturas de RNA-seq se alinearon con la secuencia del genoma completo de AB5075 utilizando el software Burrows-Wheeler Alignment (BWA). Se utilizó FeatureCounts para calcular los recuentos de lectura por gen y se empleó DEseq2 para realizar análisis de expresión diferencial. Las características que exhibieron FDR < 0,05 y cambio log2 veces > 1 se consideraron estadísticamente significativas.

El ARN extraído y tratado con ADNasa se utilizó para generar ADN complementario (ADNc) siguiendo el protocolo del fabricante proporcionado con la Supermezcla de transcripción inversa iScriptTM para qPCR (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Las concentraciones de ADNc se ajustaron a 50 ng/μl y la qPCR se realizó utilizando qPCRBIO SyGreen Blue Mix Lo-ROX siguiendo el protocolo del fabricante (PCR Biosystems, Wayne, PA, EE. UU.). Se utilizaron al menos tres réplicas biológicas de ADNc en tripletes y se ejecutaron utilizando el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 TouchTM (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Los niveles transcripcionales de cada muestra se normalizaron al nivel transcripcional de rpoB. La cuantificación relativa de la expresión génica se realizó utilizando el método de umbral comparativo 2-ΔΔCt. Las proporciones obtenidas después de la normalización se expresaron como cambios en comparación con las muestras de ADNc aisladas de cultivos de bacterias individualmente, y se usaron asteriscos para indicar diferencias estadísticamente significativas, según lo determinado por ANOVA seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey (P <0,05), usando GraphPad Prism ( GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.).

Se incubaron cultivos nocturnos de AB5075, CRL 2244 y AB5075 combinados con CRL 2244 en BHI a 37 °C durante 24 h. La densidad óptica a 600 nm (OD600) se ajustó a 0,9–1,1 y se colocaron 100 µl en una placa de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C durante 24 h sin agitación. Al día siguiente, se midió la OD600 (ODG), utilizando un lector de microplacas, para determinar la biomasa total. Los pocillos se vaciaron, se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X y se tiñeron con cristal violeta (CV) al 1% durante 15 minutos. El exceso de CV se eliminó lavando tres veces más con 1X PBS y la biopelícula asociada con CV se solubilizó en acetato de etanol (80:20) durante 30 min. Se midió la DO580 (ODB) y se determinó la relación entre biopelícula y biomasa total (ODB/ODG). Los experimentos se realizaron por triplicado y la significación estadística (P <0,05) se determinó mediante ANOVA de dos factores seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey utilizando GraphPad Prism (software GraphPad, San Diego, CA, EE. UU.).

Se preparó una solución madre de material fecal humano de donante sano obtenido comercialmente (Innovative Research, EE. UU., proveedor certificado aprobado por ISO, FDA, USDA y EPA) disolviendo 5 g en 50 ml de agua ultrapura estéril. A partir de cultivos activos de CRL 2244 cultivados en caldo MRS y AB5075 en caldo BHI y ajustados a OD600 = 0,1, se combinaron doscientos µl de cada célula con la adición de 900 µl de materia fecal y 900 µl de caldo BHI (volumen final 2 ml). ). Se utilizaron células AB5075 como controles. Después de la incubación a 37 °C durante 24 h, se determinó la viabilidad de AB5075 y los cambios en el fenotipado:

Viabilidad celular (UFC/mL): utilizando medios diferenciales como CLDE (con y sin adición de eritromicina 2 μg/mL), Levin; y medios selectivos como CHROMagar™ Acinetobacter (Chromoagar, París, Francia).

Ensayo de motilidad en agar blando (0,5% agarosa): Se prepararon placas LB con 0,5% de agarosa. De las colonias obtenidas en el ensayo de viabilidad celular, se recogieron colonias y se sembraron en la superficie de la placa de motilidad y se incubaron a 37 °C durante 24 h. El diámetro de crecimiento se midió y se clasificó como no móvil (<5 mm), moderadamente móvil (5-20 mm) o muy móvil (> 20 mm). Los experimentos se realizaron por triplicado.

Ensayos de susceptibilidad a antibióticos: De las colonias obtenidas en la prueba de viabilidad celular se evaluó la susceptibilidad a cefepima (FEP), ceftazidima (CAZ), imipenem (IMP), meropenem (MER), cefiderocol (FDC), amikacina (AK), gentamicina ( GN), ciprofloxacino (CIP), trimetoprim/sulfametoxazol (TMS) y tetraciclina (TE) mediante la técnica de difusión en disco y determinación de la concentración mínima inhibitoria de cefiderocol (FDC) y tetraciclina (TE), siguiendo los procedimientos recomendados por CLSI (2020).

Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio Gene Expression Omnibus (GEO) (número de acceso GEO GSE236782 o número de token glcdkswudzkvzuv).

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El trabajo de los autores fue apoyado por NIH SC3GM125556 para MSR, R01AI100560, R01AI063517, R01AI072219 para RAB; PICT2018-03233 a RR y PIP 2020-817 y PICT 2021-00458 a CR. Este estudio fue financiado en parte por fondos y/o instalaciones proporcionadas por el Departamento de Asuntos de Veteranos de Cleveland, premio número 1I01BX001974 a RAB del Servicio de Investigación y Desarrollo de Laboratorios Biomédicos de la Oficina de Investigación y Desarrollo de VA y el Centro Clínico y de Educación en Investigación Geriátrica. VISN 10 a RAB. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud o el Departamento de Asuntos de Veteranos. MRT y TS reciben una beca postdoctoral del CONICET.

Centro de Referencia Para Lactobacilos (CERELA), CONICET, San Miguel de Tucumán, Tucumán, Argentina

Cecilia Rodriguez, Camila Leal & Raúl Raya

Centro de Estudios de Biotecnología Aplicada, Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas, Universidad Estatal de California Fullerton (CSUF), 800 N State College Blvd, Fullerton, CA, 92831, EE. UU.

Dema Ramlaoui, Nardin Georgeos, Briea Gasca & María Soledad Ramirez

Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos de Rosario (IPROBYQ, CONICET-UNR), Rosario, Argentina

Tomás Subils

Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR, CONICET-UNR), Rosario, Argentina

Marisel R. Tuttobene

Fundación Instituto Leloir-IIBBA CONICET, Buenos Aires, Argentina

Rodrigo Sieira

Departamento de Química y Bioquímica, Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas, CSUF, Fullerton, EE. UU.

Nicolás T. Salzameda

Servicio de Investigación y GRECC, Centro Médico del Departamento de Asuntos de Veteranos, Louis Stokes Cleveland, Cleveland, OH, 44106, EE. UU.

Robert Bonomo

Departamentos de Medicina, Farmacología, Biología Molecular y Microbiología, Bioquímica, Proteómica y Bioinformática, Facultad de Medicina de la Universidad Case Western Reserve, Cleveland, OH, 44106, EE. UU.

Robert Bonomo

CWRU-Cleveland VAMC Centro de Epidemiología y Resistencia a los Antimicrobianos (Case VA CARES), Cleveland, OH, 44106, EE. UU.

Robert Bonomo

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CR, DR, NG, BG, NTS, RR y MSR concibieron el estudio y diseñaron los experimentos. CR, DR, NG, BG, CL, TS, MRT, RS, NTS, RR y MSR realizaron los experimentos y los análisis genómicos y bioinformáticos. MRT, TS, RS, NTS, CR, RAB, RR y MSR analizaron los datos e interpretaron los resultados. CR, NTS y ​​MSR contribuyeron con reactivos, materiales y herramientas de análisis. CR, RS, NTS, RAB, RR y MSR escribieron y revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondence to María Soledad Ramirez.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Rodríguez, C., Ramlaoui, D., Georgeos, N. et al. Actividad antimicrobiana de Lacticaseibacillus rhamnosus CRL 2244 y su impacto en las respuestas fenotípicas y transcripcionales en Acinetobacter baumannii resistente a carbapenémicos. Informe científico 13, 14323 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41334-8

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Recibido: 08 de julio de 2023

Aceptado: 24 de agosto de 2023

Publicado: 31 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41334-8

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