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Aug 20, 2023

bacteriana

Nature Microbiology (2023) Cite este artículo 36 Detalles de Altmetric Metrics La mayoría de los microbios evolucionan más rápido que sus huéspedes y, por lo tanto, deberían impulsar la evolución de las interacciones huésped-microbio. Sin embargo,

Microbiología de la naturaleza (2023)Citar este artículo

36 altmétrico

Detalles de métricas

La mayoría de los microbios evolucionan más rápido que sus huéspedes y, por lo tanto, deberían impulsar la evolución de las interacciones huésped-microbio. Sin embargo, se sabe relativamente poco sobre las características que definen la ruta adaptativa de los microbios a la asociación con el huésped. Aquí identificamos rasgos microbianos que median la adaptación a los huéspedes mediante la evolución experimental de la bacteria de vida libre Pseudomonas lurida con el nematodo Caenorhabditis elegans como huésped. Después de diez pases, observamos repetidamente la evolución de bacterias beneficiosas especializadas en huéspedes, y la persistencia mejorada en el nematodo se asoció con una mayor formación de biopelículas. La secuenciación del genoma completo reveló mutaciones que regulan uniformemente al alza el segundo mensajero bacteriano, el diguanilato cíclico (c-di-GMP). Posteriormente generamos mutantes con c-di-GMP regulado positivamente en diferentes cepas y especies de Pseudomonas, lo que aumentó constantemente la asociación con el huésped. La comparación de genomas de pseudomonas de diversos entornos reveló que c-di-GMP es la base de la adaptación a una variedad de huéspedes, desde plantas hasta humanos. Este estudio indica que c-di-GMP es fundamental para establecer una asociación con el huésped.

Los microorganismos asociados al huésped tienen efectos importantes sobre el funcionamiento fisiológico y la aptitud de sus huéspedes vegetales y animales1,2,3. Estas interacciones huésped-microbiota a menudo se estudian utilizando una visión centrada en el huésped, con especial atención en las funciones del huésped mediadas por la microbiota. Esta visión ignora el hecho importante de que la mayoría de los microbios evolucionan más rápido que sus huéspedes debido a sus tiempos de generación más cortos y tasas de mutación más altas y, por lo tanto, que las mejoras en la aptitud de los microbios pueden impulsar las asociaciones de manera desproporcionada4. Un paso importante en la evolución de una asociación huésped-microbio es el surgimiento de una interacción más especializada que permite que las bacterias de vida libre ingresen de manera confiable al huésped, persistan y finalmente sean liberadas en el medio ambiente para colonizar nuevos huéspedes (Fig. 1a)4 . Hasta ahora, se sabe poco sobre los rasgos y procesos moleculares que determinan cómo las bacterias se adaptan a tal asociación con el huésped.

a, Los microbios asociados al huésped pasan de una fase de vida libre a una asociación con el huésped; esta última comprende la entrada, la persistencia y la liberación del huésped. Seis poblaciones de P. lurida se pasaron diez veces a través de estas etapas con el huésped C. elegans (EVOhost) o sin el huésped como control (EVOctrl). b, Las poblaciones bacterianas adaptadas al huésped aumentaron significativamente la aptitud (dada como UFC por gusano) en relación con el ancestro (pruebas t bilaterales y comparaciones post hoc de Tukey corregidas por FDR, 6 repeticiones por tratamiento). c, Las bacterias evolucionadas siguen siendo beneficiosas para el huésped, determinada por el crecimiento de la población de nematodos (prueba t bilateral, 6 repeticiones por tratamiento). d, Un morfotipo de colonia arrugada solo surgió durante la adaptación del huésped y domina dentro de los gusanos (comparación de la abundancia de morfotipos dentro de los tratamientos: modelos lineales generalizados y prueba post hoc de Tukey corregida por FDR, 6 repeticiones por tratamiento). e, Las bacterias evolucionadas especializadas en huéspedes (etiquetadas con dTomato rojo fluorescente) colonizan el intestino del gusano (vesículas autofluorescentes en las células intestinales de los nematodos en cian). Barra de escala, 10 µm. f, la PCA de los rasgos clave del ciclo de vida asociado al huésped (en a) revela un perfil distinto para los especialistas evolucionados y arrugados del huésped en comparación con las bacterias ancestrales (consulte la Tabla complementaria 5 para conocer las mediciones de los rasgos individuales). b – d, los diagramas de caja muestran la mediana (línea central), los cuartiles superior e inferior (límites de caja) y el rango intercuartil (bigotes).

Estudiamos la transición evolutiva desde la vida libre a la asociación con el huésped a través de una evolución experimental controlada, utilizando como modelo la bacteria Pseudomonas lurida y el nematodo huésped Caenorhabditis elegans. Esta bacteria se encuentra ocasionalmente en la microbiota natural de C. elegans5,6. En condiciones de laboratorio, la presencia de P. lurida se asocia con mayores tasas de crecimiento de la población de C. elegans y puede brindar protección contra patógenos; sin embargo, tanto el huésped como la bacteria pueden proliferar uno sin el otro y, por lo tanto, no dependen uno del otro5,7,8 . Para seleccionar bacterias adaptadas al huésped, pasamos en serie 6 poblaciones de P. lurida con o sin una fase asociada al huésped (Fig. 1a; EVOhost o EVOctrl, respectivamente). Todas las poblaciones fueron inoculadas a partir del mismo ancestro clonal. Después de 10 pases a través de huéspedes, las bacterias alcanzaron en promedio una carga bacteriana de 5 a 10 veces mayor en el huésped que su ancestro, un cambio significativo no observado para el control que evolucionó sin exposición a los huéspedes pero que por lo demás tenía condiciones idénticas (Fig. 1b y Ampliada). Datos Fig. 1). El aumento de la aptitud bacteriana no tuvo un costo para el huésped, ya que el crecimiento de la población de nematodos (utilizado como indicador de la aptitud de los nematodos) no cambió significativamente, sino que aumentó en presencia de las bacterias adaptadas (Fig. 1c).

Como resultado del pasaje, las poblaciones bacterianas se diversificaron en la morfología de las colonias. Al final de nuestro experimento, un morfotipo "arrugado" era dominante en todas las poblaciones replicadas experimentales asociadas al huésped y estaba ausente en los controles, mientras que los morfotipos "borrosos" y "suaves" (ancestrales) estaban presentes en todos los tratamientos (Fig. 1d y Tabla complementaria 1). A pesar de su importante ventaja en los huéspedes, los morfotipos arrugados disminuyeron durante el crecimiento en agar, mientras que los tipos lisos y difusos aumentaron en abundancia (Datos ampliados, figura 1 y tabla complementaria 2). Como los tipos arrugados eran exclusivos de las bacterias adaptadas a los gusanos y alcanzaban una gran abundancia en ellas, los consideramos especialistas en hospedadores. Estos especialistas se pueden encontrar en grupos dentro del tracto intestinal del nematodo, especialmente en las partes anterior y posterior (Fig. 1e y Datos ampliados Fig. 2). En particular, el morfotipo arrugado evolucionado es similar al P. fluorescens arrugado que emerge en la interfaz aire-líquido en microcosmos estáticos9 y a variantes rugosas de varias bacterias patógenas10,11,12. Nuestros experimentos sugieren que este cambio morfológico también ocurre en las bacterias beneficiosas que se adaptan a la asociación con el huésped. Para una caracterización adicional de estas adaptaciones, nos centramos en 47 clones de morfotipos distintos y genéticamente estables (Tabla complementaria 3) aislados de las poblaciones finales de nuestro experimento de evolución.

Un análisis de los cambios de rasgos en las distintas etapas de la asociación con el huésped reveló adaptaciones específicas de los morfotipos arrugados a la interacción con C. elegans. En detalle, caracterizamos dos rasgos de importancia para la etapa de vida libre y cuatro rasgos para la asociación del huésped (como se enumeran en la Fig. 1a). Descubrimos que los perfiles de aislamiento arrugado eran significativamente distintos del perfil de rasgos ancestrales (Fig. 1f y Tabla complementaria 4). Esto se debió principalmente a aumentos significativos en la persistencia a corto plazo, la liberación del huésped y la formación de biopelículas in vitro (Fig. 1f, Datos ampliados, Fig. 3 y Tablas complementarias 4 a 6), todos rasgos que definen las interacciones de fase tardía con el anfitrión. El patrón general de asociación mejorada con el huésped también se recuperó al analizar las poblaciones genéticamente diversas desde el final del experimento de evolución, donde las poblaciones asociadas al huésped aumentaron de manera similar en persistencia y liberación (Datos ampliados, figura 4 y tablas complementarias 7 y 8). En detalle, la formación de biopelículas puede permitir un contacto persistente con el huésped y aumentar la tolerancia al estrés13,14, como lo ejemplifican muchos patógenos15, mejorando así la supervivencia en el tracto digestivo del nematodo. Como consecuencia del aumento de la formación de biopelículas, las células agregadas pueden ser expulsadas más fácilmente16, lo que explica el aumento observado en la liberación. Tal desprendimiento también aumenta las posibilidades de transmisión a otros huéspedes4, lo que reinicia el ciclo de asociación del huésped. En particular, los aislados arrugados no diferían de los ancestros en la colonización temprana, pero mostraron una disminución significativa en la expansión de la colonia y el enjambre en las placas (Fig. 1f, Datos ampliados, Fig. 3 y Tablas complementarias 4 y 5). Este último resultado es consistente con una disminución en la motilidad descrita para E. coli que evolucionó para convertirse en mutualista en las chinches apestosas17, pero contrasta con los hallazgos de que se requiere un enjambre suficiente para el inicio de la colonización del pez cebra y el calamar bobtail18,19. Estos contrastes probablemente se deban a diferencias en el reclutamiento de simbiontes entre los sistemas huéspedes, definidos por ambientes acuáticos para el pez cebra y el calamar, o ambientes terrestres para C. elegans y chinches. Además, nuestras observaciones de una mayor formación de biopelículas y una motilidad reducida pueden indicar una compensación evolucionada en la historia de vida entre los rasgos que definen la asociación del huésped y la etapa de vida libre. Concluimos que la evolución experimental en presencia del huésped nematodo conduce a la aparición y propagación de un tipo de huésped especialista. A continuación preguntamos si la asociación mejorada con el huésped tiene una base genética común.

La secuenciación del genoma completo de los morfotipos aislados y el ancestro reveló varias mutaciones independientes en los especialistas del huésped arrugado que afectan al segundo mensajero bacteriano diguanilato cíclico (c-di-GMP). En particular, una comparación de la variación genómica no silenciosa identificó genes variantes específicos de los especialistas del huésped arrugado (Fig. 2a y Tabla complementaria 9). Dos de los genes, wspE y wspF, codifican para un sensor híbrido histidina quinasa y una metilesterasa en el operón Wrinkly Spreader (wsp), respectivamente20. Estos genes son parte de un sistema de dos componentes que regula los niveles de c-di-GMP (Fig. 2g) y la formación de arrugas en proteobacterias beta y gamma, incluidas las pseudomonas20,21,22,23. Encontramos mutaciones adicionales exclusivas de los especialistas del huésped en el gen rph, que codifica la RNasa PH que no se ha relacionado previamente con la señalización de c-di-GMP. Utilizando un sensor de c-di-GMP basado en fluorescencia y cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), encontramos un aumento de aproximadamente el doble de c-di-GMP en tres aislados arrugados, cada uno con una única mutación en wspE, wspF. o rph, en comparación con el antepasado (Fig. 2b, Datos ampliados, Fig. 5 y Tabla complementaria 10). Esto apunta a una mutación de pérdida de función en wspF (que regula negativamente c-di-GMP) y alteraciones en los sitios activos de WspE y Rph que convergen en la regulación positiva de c-di-GMP. Alineamos secuencias de aminoácidos evolucionadas y ancestrales (Datos extendidos, Fig. 6) y confirmamos una interrupción en los dominios funcionales de WspF, así como un dominio receptor interrumpido en WspE que probablemente previene su desautofosforilación y, por lo tanto, activa constantemente WspR24 aguas abajo. Las sustituciones de aminoácidos en el dominio exoribonucleasa de Rph vinculan aún más su actividad ribonucleasa con el metabolismo de c-di-GMP. Como observamos aumentos similares en los niveles de c-di-GMP en otros mutantes arrugados, pero no en los mutantes lisos o borrosos (Datos ampliados, Fig. 5), posteriormente preguntamos si las mutaciones específicas de las arrugas realmente causan una mejor asociación con el huésped.

a, Descripción general de genes con cambios no silenciosos en aislados bacterianos evolucionados. Los puntos de datos representan aislados mutantes con una o múltiples mutaciones en un gen determinado (el número total de aislados con una morfología determinada se especifica entre paréntesis). Un cruce indica genes con variantes perdidas en los aislados evolucionados en comparación con el ancestro. b, el sensor de fluorescencia y la LC-MS detectaron concentraciones intracelulares más altas de c-di-GMP en mutantes arrugados evolucionados en comparación con el antepasado (ANOVA de Welch y comparaciones post hoc de Games-Howell, 5 réplicas por tratamiento). Barras de escala, 10 µm. c, Aptitud competitiva (cfus por gusano en relación con el ancestro, línea discontinua) de mutantes wspF, wspE y rph evolucionados (izquierda), mutantes rescatados (centro) y mutantes reconstruidos en antecedentes ancestrales (derecha) durante la persistencia en C. elegans MY316 (3 < norte < 5). d, Aptitud competitiva de los mutantes wspF, wspE y rph evolucionados durante la persistencia en la cepa N2 de C. elegans no nativa (8

Un análisis genético funcional de wspE, wspF y rph demostró su participación directa en la adaptación del huésped. Para este análisis, evaluamos la aptitud competitiva de los mutantes en relación con el ancestro durante la colonización del huésped. Primero, reevaluamos los tres mutantes arrugados seleccionados y descubrimos que eran significativamente más competitivos que el ancestro (Fig. 2c, panel izquierdo y Tabla complementaria 11), junto con una mayor formación de biopelículas y una disminución del enjambre in vitro (Datos ampliados, Fig. 7 y cuadro complementario 12). A partir de entonces, rescatamos a estos mutantes con los alelos ancestrales correspondientes, lo que de hecho abolió el aumento de aptitud de los mutantes (Fig. 2c, panel central y Tabla complementaria 11). En tercer lugar, una introducción experimental de cada mutación en el entorno ancestral resultó en una competitividad significativamente mayor, al menos para las mutaciones wspF y rph (Fig. 2c, panel derecho y Tabla complementaria 11). Se observó una ventaja de aptitud similar para los mutantes wspE y wspF cuando cualquiera de ellos fue sometido a una competencia de cuarteto con el ancestro y los otros dos morfotipos (Datos ampliados, figura 8 y tabla complementaria 13). En particular, las ventajas de aptitud física de los mutantes evolucionados se observaron consistentemente en una cepa huésped no nativa (la cepa de laboratorio N2 de C. elegans) (Fig. 2d y Tabla de datos complementarios 14). Si bien dos de estos genes son componentes del sistema Wsp, que regula c-di-GMP durante la detección de superficie en otras pseudomonas25,26, Pl_MYb11 en teoría posee una variedad de enzimas modificadoras de c-di-GMP. Esto incluye 34 genes que codifican GGDEF y 22 que codifican dominios EAL con funciones putativas de diguanilato ciclasa (DGC) y fosfodiesterasa específica de c-di-GMP (PDE), respectivamente. Validamos el papel del DGC afín del sistema Wsp en la adaptación del huésped utilizando inactivaciones de wspR en nuestros mutantes evolucionados especialistas en huésped. Este cambio abolió la ventaja competitiva de los mutantes en el huésped (Fig. 2e) y provocó un cambio de la morfología de la colonia arrugada a suave (Datos ampliados, Fig. 7 y Tabla complementaria 15), vinculando así el DGC wspR con wspE y wspF (como se esperaba). ) y rph (anteriormente desconocido). Además, manipulamos directamente los niveles de c-di-GMP mediante la expresión heteróloga de una PDE y una DGC de P. aeruginosa23,27, lo que resultó respectivamente en una persistencia disminuida o mejorada en C. elegans, como se esperaba (Fig. 2f, Ampliada). Datos Fig. 7 y Tabla complementaria 16). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que los cambios en wspE, wspF y rph que convergen en niveles crecientes de c-di-GMP a través del sistema Wsp mejoran la aptitud bacteriana en el huésped (Fig. 2g). Como la regulación positiva de este segundo mensajero media un cambio fundamental en la historia de vida13, a continuación investigamos si de manera más general media la asociación del huésped entre pseudomonas.

La manipulación genética de wspF y un análisis bioinformático de los genomas de Pseudomonas revelaron una participación general de los genes wsp en la asociación del huésped. Para el primero, generamos mutantes de eliminación de wspF para la cepa MYb193 de P. lurida y la cepa MYb187 de P. alquilfenolia lejana (ambas asociadas naturalmente con C. elegans), y además obtuvimos la cepa SBW25 de P. fluorescens mutante y de tipo salvaje, un modelo para la formación de arrugas21 . Descubrimos que los mutantes tenían una aptitud competitiva significativamente mayor en el huésped de C. elegans que sus respectivos tipos salvajes (Fig. 3a y Tabla complementaria 17). Además, correlacionamos la presencia de genes wsp y rph en 1359 genomas completos de Pseudomonas del NCBI con la fuente de aislamiento bacteriano, un indicador del estilo de vida (Datos ampliados, figura 9 y tabla complementaria 18). Los aislados de Pseudomonas que contienen cualquiera de los genes wsp o el operón wsp completo y altamente sintético (Tabla complementaria 19) 20 se aislaron significativamente más a menudo de un huésped que los aislados que carecen de estos genes (Fig. 3b y Tabla complementaria 19). Estos hallazgos pueden parecer sorprendentes para genes con efectos reguladores opuestos (por ejemplo, wspE versus wspF), pero probablemente se expliquen por la herencia sinténica de todo el operón con su conjunto de genes que interactúan (Tabla complementaria 19; ver también ref. 20). Además, rph fue más prevalente en aislados de huéspedes sanos/no diagnosticados que en huéspedes enfermos. En todos los estilos de vida, también detectamos firmas de selección negativa para wspE, wspF y rph, lo que además sugiere que están funcionalmente estabilizados por selección cuando están presentes (Tabla complementaria 20). Proponemos que la presencia de estos genes permite la regulación precisa de c-di-GMP y, por lo tanto, la adaptación a un estilo de vida asociado al huésped.

a, la eliminación de WspF aumenta la aptitud competitiva intrahospedador de diferentes especies de Pseudomonas en relación con su tipo salvaje (cfus por gusano, tipo salvaje indicado por la línea discontinua; pruebas post hoc de Dunnett corregidas por LMM y FDR, 3

En conjunto, nuestro estudio demuestra que las bacterias pueden mejorar su asociación con un huésped al cambiar su historia de vida de un estilo de vida móvil a uno sésil y persistente. Este cambio en el estilo de vida es el resultado de cambios correlacionados en un conjunto de rasgos de la historia de vida (Fig. 1f), que en conjunto representan una transición en la estrategia de la historia de vida. Una forma de interpretar esta transición es como un cambio a lo largo del continuo de la historia de vida r-K, desde una estrategia tipo r caracterizada por altas tasas de reproducción a una estrategia tipo K caracterizada por la persistencia en condiciones de alta densidad28,29. Para demostrar si tal transición generalmente conduciría a una mayor asociación con el huésped, utilizamos una extensión de un modelo matemático previamente publicado de evolución microbiana hacia la asociación con el huésped30. La exploración de un amplio espacio de parámetros con este modelo confirmó que una mayor persistencia dentro del huésped es a menudo la estrategia óptima para la adaptación microbiana a los huéspedes (Datos ampliados, figura 10 y discusión complementaria), lo que sugiere que los resultados de nuestro estudio pueden ser aplicables en general.

En nuestros experimentos, el cambio de estilo de vida de vida principalmente libre a vida asociada al huésped está mediado por el sistema Wsp y, posteriormente, por la actividad del segundo mensajero bacteriano c-di-GMP. Se sabe que el C-di-GMP regula funciones fisiológicas clave en las bacterias, incluida la regulación de la virulencia en patógenos bacterianos22,31. Nuestro trabajo demuestra que este sistema regulador promueve la adaptación de pseudomonas a diversos sistemas huésped, desde plantas hasta humanos, no solo en patógenos sino que se extiende a relaciones beneficiosas entre huésped y bacteria. Dada la importancia de los microorganismos benéficos en el funcionamiento de sus huéspedes, es crucial comprender los mecanismos que median las asociaciones no patógenas. Nuestro estudio sugiere que c-di-GMP desempeña un papel esencial en muchas de estas asociaciones.

Realizamos experimentos de evolución con la cepa MYb11 de P. lurida (Pl_MYb11) y su cepa huésped natural C. elegans MY316 (Ce_MY316) (ref. 5). En preparación para todos los experimentos, descongelamos reservas de lombrices congeladas (-80 °C) y criamos lombrices en agar medio de crecimiento de nematodos (NGM32) sembrado con E. coli OP50. En experimentos adicionales de colonización de persistencia, utilizamos la cepa de laboratorio estándar C. elegans N2 como huésped no nativo para las bacterias evolucionadas. Se utilizó un protocolo de blanqueo estándar para recolectar larvas L1 estériles y sincronizadas, que luego se elevaron a la etapa L4 en E. coli OP50 (20 °C), a menos que se indique lo contrario.

Las cepas de P. lurida MYb11 y MYb193, y P. alquilfenolia MYb187 se aislaron de Ce_MY316 (ref. 5), y P. fluorescens SBW25 de hojas de remolacha azucarera9. Las bacterias se cultivaron en agar de soja tríptico (20 °C, 48 h) y caldo de soja tríptico (28 °C, 150 rpm, durante la noche) a menos que se indique lo contrario.

Las poblaciones bacterianas que se originan a partir de un clon de Pl_MYb11 se pasaron en serie en NGM en presencia de Ce_MY316 (tratamiento con huésped, 6 réplicas) o sin gusanos (control negativo, 6 réplicas). Para cada réplica, se sembró un césped de Pl_MYb11 en NGM y se cultivó durante 3,5 días. Para cada ciclo del tratamiento con el huésped, se agregaron 10 larvas de C. elegans L4 por placa y se incubaron hasta que los gusanos alcanzaron la generación F1 (3,5 días). En los controles negativos, las bacterias se mantuvieron en NGM sin gusanos. Al final de cada ciclo, se recogieron bacterias de lombrices o placas en los tratamientos asociado al huésped y de control, respectivamente, el 10% de la población (cuello de botella) se transfirió al siguiente ciclo y se congeló una muestra (-80 °C). . Se utilizó un número similar de unidades formadoras de colonias (ufc) para obstruir el control negativo. Se realizaron un total de 10 ciclos.

Se recuperaron las bacterias congeladas del ciclo 10 y, antes de realizar más experimentos, se sometieron a un ciclo más del experimento de evolución para minimizar cualquier posible efecto selectivo de la congelación/descongelación. Para centrarse en las diferencias evolucionadas entre las poblaciones del tratamiento huésped y el control negativo, en lugar de respuestas fisiológicas a la exposición reciente del huésped, se cultivaron bacterias en NGM durante 2 días como tratamiento de jardín común y luego se usaron en ensayos posteriores.

La aptitud bacteriana durante la asociación con el huésped se cuantificó como ufc por gusano. En preparación, se sembraron céspedes bacterianos (125 µl, densidad óptica (OD) 600 = 2) en NGM y se agregaron 5 L4 Ce_MY316 sincronizados. Después de 3,5 días a 20 °C, los gusanos se recogieron con tampón M9 que contenía Triton-100 al 0,025% y 25 mM del tetramisol antihelmíntico paralizante. Los gusanos se lavaron en tampón utilizando un sistema de lavado de puntas de filtro hecho a medida33 y se recogieron en M9 con Triton-100. Se recogió sobrenadante libre de gusanos como muestra de fondo. Después de la homogeneización mediante batido de perlas, se utilizaron diluciones en serie y placas para cuantificar las UFC. Las UFC por gusano se calcularon como la diferencia en UFC entre las muestras de gusanos y sobrenadante, dividida por el número de gusanos por población. Para poblaciones diversificadas, las morfologías de las colonias se calificaron como suaves, borrosas o arrugadas.

El crecimiento de la población de lombrices resultante de 5 larvas L4 durante 3,5 días se cuantificó como un indicador de la aptitud del huésped. Se prepararon bacterias y gusanos como para ensayos de colonización y los gusanos lavados se congelaron en placas de 48 pocillos. Las fotografías de gusanos se calificaron automáticamente en ImageJ2 (ref. 34): los gusanos se detectaron como partículas, aproximadas por elipses, y aquellas que se ajustaban a dimensiones similares a las de C. elegans (eje mayor 0,18–1,3 mm, eje menor ≤0,1 mm (ref. 35 )) fueron contados. La calidad de la detección se validó correlacionando los recuentos automáticos de gusanos con los recuentos de dos experimentadores independientes (r(58) = 0,736, P = 2,106 × 10−11).

Para cuantificar la colonización temprana, la persistencia y la liberación de los gusanos en etapa L4, se prepararon céspedes bacterianos a partir de Pl_MYb11 ancestral y poblaciones evolucionadas (post jardín común) o morfotipos clonales (cultivos nocturnos). En los primeros ensayos de colonización, cuantificamos las bacterias que ingresaron a L4 Ce_MY316 y que previamente se criaron en E. coli O50 no colonizadora. Luego se ensayaron los niveles de colonización como anteriormente, dando como resultado ufc por gusano como medida de colonización temprana.

Para los ensayos de persistencia y liberación, se criaron gusanos en las bacterias de ensayo respectivas (desde la etapa L1 hasta la etapa L4), imitando el desarrollo de los gusanos en la generación F1 del experimento de evolución. Luego se recogieron los gusanos, se lavaron usando el sistema de lavado de puntas de filtro y las muestras se dividieron en sobrenadante (sobrenadante 1) y muestra de gusano (100 µl cada una). Luego se suspendieron los gusanos en 200 µl de M9 y se incubaron durante 1 h, después de lo cual se recogieron 100 µl de sobrenadante que contenía las bacterias liberadas (sobrenadante 2). Las ufc liberadas por gusano se determinaron por la diferencia en ufc entre el sobrenadante 2 y el sobrenadante 1. Junto con esto, cuantificamos las ufc mantenidas en los gusanos de esta muestra como una medida de persistencia.

Para medir el crecimiento bacteriano, las poblaciones bacterianas (tratamiento de jardín común o cultivos nocturnos) se ajustaron a OD600 = 0,1 y se aplicaron 50 µl en NGM. Después de la incubación (24 h o 3 días a 20 °C), el césped se raspó, se homogeneizó y se determinaron las ufc mediante dilución en serie.

La expansión y el enjambre de colonias se analizaron en NGM que contenía 0,5% o 3,4% de agar, respectivamente. En cualquier caso, se colocaron 0,5 µl de suspensión celular (OD600 = 1) en placas de agar con superficie seca. El diámetro de las colonias se midió después de 24 h, 3 y 7 días.

La formación de biopelículas in vitro se analizó en placas de microtitulación como se describió anteriormente36. En particular, los ensayos se realizaron en un diseño aleatorio en placas tratadas con superficie Nunclon Delta. La tinción se realizó después de 48 h de incubación (20 °C, agitación orbital a 180 rpm). La absorción de las soluciones de biopelículas teñidas se midió a 550 nm utilizando un lector de microplacas Gen5 y el software Imager (Biotek, v.3.08.01). Para ilustrar la formación de biopelículas en líquido, se llenaron tubos de ensayo de vidrio con 2 ml de caldo de soja tríptico, se inocularon con colonias individuales de Pl_MYb11 ancestral o mutantes evolucionados especializados en huéspedes (wspE, wspF, rph) y se incubaron a 20 °C durante 48 h hasta fotografiar. .

Se aislaron colonias representativas con morfologías visualmente distintas de poblaciones evolucionadas del ciclo 10. Las poblaciones evolucionadas se descongelaron, se diluyeron en serie y se sembraron en placas (48 h, 20 °C). Los morfotipos únicos de todas las poblaciones evolucionadas se volvieron a rayar y archivaron como reservas congeladas (Tabla complementaria 3). Todos los morfotipos se descongelaron y se volvieron a rayar una vez, y mostraron una morfología de colonia estable durante 2 días de incubación.

Las macrocolonias de morfotipos y mutantes Pl_MYb11 se prepararon como se describió anteriormente37. Brevemente, se colocaron 5 µl de cultivo nocturno en placas de agar de soja tríptico suplementado con 40 µg ml-1 de rojo Congo y se incubaron a 20 °C. Después de 24 h o 48 h, se tomaron fotografías utilizando un telescopio de disección de fluorescencia Leica (LEICA M205 FA).

El morfotipo arrugado MT12 se marcó con dTomato (dT) fluorescente rojo utilizando inserción cromosómica basada en transposón Tn7 como se describió anteriormente38,39. La inserción de la etiqueta no afectó la morfología arrugada de las colonias.

Se utilizó MT12 marcado con fluorescencia para localizar la colonización en Ce_MY316 mediante microscopía de barrido láser confocal (ZEISS LSM 880). Para esto, se expusieron larvas sincronizadas en etapa L1 a bacterias marcadas durante 72 h (20 °C), luego se recogieron mediante lavado por gravedad y se montaron para microscopía como se describió anteriormente39. Se crearon resúmenes de gusanos completos utilizando un objetivo multiinmersión apocromático plano LCI ×25 LD (apertura numérica (NA) = 0,8) y se obtuvieron imágenes de detalles utilizando un objetivo de inmersión en agua apocromático ×40 C (NA = 1,2), en ambos casos. utilizando Immersol W (2010) con un índice de refracción de 1,334. La fluorescencia bacteriana y la autofluorescencia de gusanos se excitaron secuencialmente (561 nm y 488 nm) y se detectaron con un detector Airyscan (modo de sensibilidad RS; filtro de paso largo ≥570 nm; filtro de paso de banda 495–550 nm). Los datos se procesaron con la función de procesamiento automático Airyscan de ZEISS Efficient Navigation 2. Para obtener una lista de las bacterias genéticamente modificadas utilizadas en este estudio, consulte la Tabla complementaria 21. Después de observar la colonización de >10 gusanos en al menos 3 poblaciones biológicas replicadas de Semanas consecutivas de experimentos, se tomaron imágenes de un gusano representativo para la Fig. 1e y la Fig. 2 de datos ampliados.

El ADN total se aisló utilizando un protocolo basado en bromuro de cetiltrimetilamonio40. Para la secuenciación de Illumina MiSeq (extremo pareado, 300 pb), las bibliotecas se prepararon utilizando el kit Nextera DNA Flex. La calidad de la lectura se inspeccionó con FastQC (v.0.11.8) (ref. 41) y las lecturas se recortaron con Trimmomatic (v.0.3.9) (ref. 42). Las lecturas emparejadas se alinearon con el genoma de referencia Pl_MYb11 (RefSeq: GCF_002966835.1; Bowtie2 v.2.3.3 (ref. 43)) y las regiones duplicadas se eliminaron usando Picardtools (v.2.22.2) (ref. 44). Las variantes se llamaron usando BCFtools (v.1.10.2) (ref. 45) y VarScan (v.2.3.9) (ref. 46), y luego se anotaron (snpEff47,48). Filtramos variantes no sinónimas que no están presentes en el control ancestral en R49,50. La ontología genética se infirió utilizando Pseudomonas.com51. Para inferir genes que codifican enzimas con supuesta actividad DGC o PDE, buscamos proteínas con dominios GGDEF y EAL utilizando el InterProScan de la base de datos de dominios conservados (CDD) a través de Pseudomonas.com51.

Para preparar alineamientos de secuencias de aminoácidos de WspE, WspF y RPH ancestrales y mutados, las secuencias de nucleótidos se tradujeron usando EMBOSS Transeq52 (cuadro 1; tabla de codones bacterianos; hacia adelante para wspE y wspF, hacia atrás para rph) y las secuencias de aminoácidos resultantes se alinearon usando Clustal Omega52. (v.1.2.4; ClustalW con recuento de caracteres y configuración estándar). Para la anotación y visualización de dominios de proteínas, las predicciones de dominio de las secuencias respectivas se recopilaron de Pfam/InterPro (obtenido de Pseudomonas.com51) y se resaltaron visualmente en visualizaciones de proteínas preparadas con DOG (v.2.0)53.

Para cuantificar las concentraciones intracelulares de c-di-GMP en Pl_MYb11 ancestral y aislados arrugados evolucionados (MT12: wspFEVO, MT14: wspEEVO y MT22: rphEVO), utilizamos un biosensor establecido basado en plásmidos54. Las cepas bacterianas que portaban el plásmido se cultivaron en placas selectivas para gentamicina (70 h, 20 °C). Para la microscopía, se resuspendieron colonias individuales en PBS 1X, se colocaron manchas en parches de agarosa al 2% en portaobjetos de microscopía y se sellaron.

La fluorescencia bacteriana se visualizó mediante microscopía de barrido láser confocal (ZEISS LSM 700 con objetivo de inmersión en aceite Plan-Apochroma ×40 (NA = 1,4) e Immersol 518F con un índice de refracción de 1,518). La fluorescencia del sensor y el normalizador se excitaron secuencialmente (555 nm y 488 nm) y se detectaron con un detector de tubo fotomultiplicador y una luz transmisora ​​dicroica secundaria variable con longitudes de onda ≤630 nm y ≤550 nm, respectivamente. Las configuraciones de excitación y detección se mantuvieron idénticas en todas las mediciones.

La intensidad de fluorescencia por celda se midió en la imagen J34: todas las celdas y cinco áreas de fondo se identificaron como regiones de interés, y se midieron el área, la densidad integrada y los valores de gris medios. Los datos de las imágenes no transformadas se utilizaron para calcular la fluorescencia celular total corregida55.

Además de las mediciones unicelulares, cuantificamos c-di-GMP a nivel de población. Para esto, se cultivaron colonias de aislados evolucionados arrugados (MT12, MT21, MT25, MT26), lisos (MT13, MT33) y difusos (MT11) como se describe anteriormente, se resuspendieron en 1X PBS y se ajustaron a OD600 = 0,1. Luego se transfirieron suspensiones celulares (200 µl) a placas negras de 96 pocillos de fondo plano con fondos transparentes (Greiner Bio-One CELLSTAR de 96 pocillos, tratadas con cultivo celular) por triplicado. Después de agitar (10 s, agitación orbital con una amplitud de 1 mm), se excitó secuencialmente la fluorescencia (454 nm y 460 nm, ancho de banda de 9 nm, 10 destellos) y se detectó la emisión (585 nm y 510 nm, ancho de banda de 20 nm; ganancia óptima, 20 Integración µs) en un lector de placas (Tecan, Infinite M200Pro), con 1X PBS como control de fondo.

Para inferir la concentración de c-di-GMP, calculamos la intensidad de fluorescencia relativa, o la relación entre las intensidades de fluorescencia de TurboRFP y AmCyan, como se describió anteriormente54, y comparamos las intensidades de fluorescencia relativas promedio entre Pl_MYb11 ancestral y los morfotipos evolucionados arrugados, lisos y difusos. Para las imágenes utilizadas en la Fig. 2, se utilizó LUT lineal en rango completo. El brillo y el contraste se aplicaron por igual a todas las imágenes.

Para cuantificar el c-di-GMP intracelular utilizando LC-MS en modo de monitoreo de reacción en paralelo, se cultivaron Pl_MYb11 ancestrales y evolucionados (MT12, MT14 y MT22) en medio LB hasta una DO600 de 1,8 y se sedimentaron mediante centrifugación. Después de lavar con medio LB sin sal, las células sedimentadas se congelaron rápidamente y se almacenaron (-80 °C). Las células se mezclaron con 10 pmol de estándar interno (di-GMP-13C20,15N10 cíclico, Toronto Research Chemicals) en 60 µl de agua. La extracción de c-di-GMP se realizó como se describió anteriormente56 con las siguientes modificaciones: se agregó una solución de extracción (240 µl de acetonitrilo (ACN)/metanol (MeOH) 1:1) y las muestras se agitaron vigorosamente. Después de la incubación en hielo (15 min) y la centrifugación (20.800 x g, 4 °C, 2 min), se recogió el sobrenadante del extracto y se repitió la extracción con disolvente dos veces (200 μl de ACN/MeOH/agua 2:2:1). Los extractos combinados se secaron, se resuspendieron en 50 µl de agua y se centrifugaron para eliminar los compuestos insolubles. Las concentraciones de precipitados de proteínas solubilizadas se determinaron utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Fisher). Para LC-MS/MS, se inyectó 1 μl de extracto en un UHPLC EASY-nLC 1000 (Thermo Fisher) y se separó en una columna nano LC ReproSil-Pur C18-AQ de 15 cm (diámetro interno de 0,1 mm, 1,9 μm, 120 Å, Altmann Analytik) a 400 nl min-1. El eluyente A fue NH4OAc 10 mM con HAc al 0,1 %, el eluyente B fue MeOH al 100 %. Las condiciones cromatográficas fueron 5% de eluyente B (5 min), seguido de un gradiente lineal del 5% al ​​20% B (15 min) y un aumento al 70% B (1 min), seguido de 70% B (5 min) y 5% B (5 min); La disociación por colisión de mayor energía de los precursores m/z 691,1021 y m/z 721,0714 se realizó en un Q Exactive HF Orbitrap MS (Thermo Fisher). Las áreas de pico para los iones del producto calificado57 m/z 248,0778 (ligero) y m/z 263,0965 (pesado) determinadas en Skyline (v.21.1.0.146.3, software MacCoss Lab)58 se utilizaron para calcular las cantidades totales de c-di-GMP. , que se normalizaron a la cantidad total de proteína obtenida mediante el ensayo BCA.

Se utilizó un método de reemplazo alélico de dos pasos basado en protocolos descritos previamente21,59 para introducir los alelos mutantes evolucionados en un entorno ancestral y también para revertir mutaciones mediante la introducción de alelos ancestrales en el entorno mutante. Aplicamos las siguientes modificaciones: se clonaron amplicones de PCR de ~ 700 pb de largo que rodeaban cada mutación en pUISacB, lo que permitió la selección de sacarosa. Las construcciones se transformaron en células de E. coli competentes y se transfirieron a aislados de Pseudomonas mediante apareamiento conjugativo con una cepa auxiliar de E. coli que contenía pRK2013 (ref. 60). Los cebadores (consulte la Tabla complementaria 22) se diseñaron utilizando la herramienta BLAST61 de NCBI y NCBI Primer-BLAST62, NEBuilder v.2.3.0 (New England Biolabs) y Oligo Analyze Tool (Eurofins Genomics). BLASTn y las alineaciones con Clustal Omega63 se realizaron utilizando la configuración predeterminada.

Para manipular los niveles intracelulares de c-di-GMP y estudiar las consecuencias para la asociación del huésped y la morfología de la colonia, expresamos una PDE heteróloga y un DGC heterólogo en nuestros mutantes evolucionados especializados en huésped (wspE, wspF y rph). La PDE PA2133 de P. aeruginosa se expresó a partir del plásmido pJN2133 (ref. 23). Se sintetizó una construcción de fusión GCN4-WspR constitutivamente activa (Eurofins) y luego se clonó en pJStrep para generar una construcción GCN4-WspR marcada con StrepII C-terminal. Se utilizaron pJStrep vacío (un vector pJN105 modificado (ref. 64) que contiene la secuencia codificante de la etiqueta StrepII) y plásmidos pJN105 vacíos como controles. Todos los plásmidos se introdujeron en Pl_MYb11 y evolucionaron mutantes utilizando un protocolo de electroporación previamente descrito65.

Los experimentos de competencia se realizaron como se describe para los ensayos de persistencia a corto plazo. Las bacterias coinoculadas se ajustaron en DO y se mezclaron en volúmenes iguales antes de sembrarlas como césped en agar NGM. Se utilizó un Pl_MYb11 marcado con dTomato39, que es equivalente al Pl_MYb11 ancestral, ya que no se observaron diferencias en la persistencia a corto plazo (análisis de varianza (ANOVA), valor F = 0,99, gl = 1, P = 0,35). Las ufc por gusano se determinaron restando las ufc en los sobrenadantes de las de las muestras de gusanos. Se calculó un índice competitivo como la relación entre ufc por gusano de mutantes evolucionados o construidos y ufc por gusano del ancestro.

Se extrajeron secuencias del genoma completo del NCBI para genes moduladores de c-di-GMP (enfoque: operón wsp, rph) con estilo de vida bacteriano en miembros del género Pseudomonas. Primero, se obtuvieron los genomas candidatos (herramienta de búsqueda de línea de comandos de NCBI Nucleotide; tamaño: 5 a 8 millones de pb). Esto recuperó 2279 secuencias, para las cuales se recopiló información de muestra de la base de datos Biosample del NCBI. Cuando estuvieron disponibles, se utilizaron el huésped, el estado de la enfermedad del huésped, la fuente de aislamiento y el tipo de muestra para clasificar manualmente los genomas como provenientes de aislados de vida libre o asociados al huésped con o sin enfermedad desconocida (Tabla complementaria 18). A continuación, descargamos todas las secuencias de referencia de Pseudomonas disponibles para los genes rph y wsp de pseudomonas.com51. Estos se usaron para identificar secuencias candidatas de rph, wspA, wspB, wspC, wspD, wspE, wspF y wspR. Estos candidatos a genes diana se encontraron en los genomas seleccionados utilizando BLAST (paquete R 'rBLAST') y se filtraron en función de las longitudes de secuencia y el porcentaje de identidades de los aciertos de BLAST (Datos ampliados, Fig. 9). Se seleccionaron el porcentaje de identidad y la longitud de la secuencia para maximizar la posibilidad de que los genes se identificaran correctamente (rectángulos rojos en la figura 9 de datos ampliados). Si se identificó al menos un gen candidato durante las búsquedas BLAST con los genes de referencia como consulta, este gen se consideró presente en el genoma respectivo. Luego utilizamos pruebas de bondad de ajuste de χ2 para inferir si los aislados con y sin los genes diana diferían en las proporciones relativas de los estilos de vida asociados al huésped (Tabla complementaria 19).

Para evaluar si nuestros genes focales especializados en huéspedes (wspE, wspF, rph) estaban experimentando una selección positiva o purificadora en el género Pseudomonas, realizamos alineamientos de secuencias múltiples de secuencias de nucleótidos basadas en codones MUSCLE (ver conjunto de datos descrito anteriormente) usando MEGA11 (ref. 66; configuración predeterminada). Posteriormente, realizamos pruebas z basadas en codones (configuraciones predeterminadas) para detectar desviaciones significativas de la selección neutral. Además, analizamos firmas de selección en aciertos de Blast para un conjunto de tres genes centrales de Pseudomonas (gyrB: PA0004, rpoD: PA0576 y una 16S rRNA metiltransferasa: PA0419; ver también ref. 67) en el conjunto de genomas estudiados para wsp y Presencia/ausencia de rph, utilizando también múltiples alineamientos de secuencias y pruebas de neutralidad basadas en codones.

Antes de la recopilación de datos, no se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar los tamaños de las muestras, pero los tamaños de nuestras muestras son similares a los informados en publicaciones anteriores. En todos los experimentos, los tratamientos y las muestras fueron cegados y aleatorizados. Antes del análisis de los datos, los supuestos de los modelos paramétricos (normalidad, homogeneidad de varianzas) se verificaron mediante inspección visual (gráficos de caja/qq) y con pruebas de Shapiro-Wilk y Levene. Cuando estos no se cumplieron se aplicaron pruebas no paramétricas. Los diagramas de caja muestran la mediana (línea central), los cuartiles superior/inferior (límites de la caja) y rangos intercuartiles de 1,5× (bigotes).

Para comprobar si las poblaciones evolucionadas diferían del ancestro en ufc por gusano, comparamos el cambio en el fenotipo evolucionado (relación de ufc por gusano de poblaciones evolucionadas con respecto a las de Pl_MYb11 ancestral) con el fenotipo ancestral utilizando pruebas t de una muestra (alfa = 0,05, mu = 1) con corrección de tasa de descubrimiento falso (FDR68) para pruebas múltiples. Aplicamos este enfoque para analizar: colonización bacteriana de gusanos individuales, crecimiento de la población de gusanos, colonización temprana, persistencia y liberación, expansión de colonias y enjambre. Para inferir cambios fenotípicos generales según el tratamiento evolutivo, se realizó un análisis de componentes principales (PCA) que incluía los fenotipos analizados. Realizamos un análisis permutacional de varianzas (PERMANOVA, 1000 permutaciones) seguido de comparaciones por pares de grupos (corregido por FDR) para probar diferencias en conjuntos de fenotipos de grupos ancestrales y evolucionados, y trazamos elipses de confianza (una desviación estándar). Los paquetes utilizados incluyeron ggbiplot69, missMDA70, vegan71 y pairwise.adonis72.

Las diferencias en las proporciones de las diferentes morfologías de las colonias (arrugadas, lisas y difusas) dentro de los gusanos se identificaron utilizando modelos lineales generalizados (GLM; distribución cuasinormal) con pruebas post hoc de Tukey (usando lme4 (ref. 73), lmtest74 y multcomp75).

Los cambios en las proporciones de morfotipo a lo largo del tiempo se probaron mediante regresiones beta (utilizando gamlss76).

Las diferencias entre los fenotipos morfotípicos se detectaron mediante ANOVA o GLM, seguidos de las pruebas post hoc de Tukey o Dunnett. Para inferir especializaciones funcionales entre fenotipos, utilizamos PCA y PERMANOVA.

Las diferencias en la formación de biopelículas y la motilidad entre los especialistas evolucionados del huésped arrugado (mutantes wspE, wspF y rph) y el Pl_MYb11 ancestral se analizaron utilizando ANOVA anidados seguidos de pruebas post hoc de Tukey. Cuando no se detectaron efectos de lote (población de origen evolucionada), se compararon los mutantes entre poblaciones. Sin embargo, en el caso de los diámetros de enjambre, el mutante rph se comparó con el ancestral Pl_MYb11 coanalizado mediante una prueba t.

Las diferencias en las concentraciones de c-di-GMP entre aislados evolucionados se infirieron utilizando ANOVA de Welch, ANOVA anidado o ANOVA con comparaciones post hoc de Games-Howell o Dunnett.

Probamos las diferencias en ufc por gusano entre morfotipos o mutantes utilizando GLM y modelos lineales mixtos (LMM), y comparaciones post hoc de Dunnett o Tukey.

Todos los análisis y trazados se realizaron en R49,50,77,78.

Construimos un modelo para evaluar el gradiente de selección experimentado por las bacterias durante el experimento de evolución (Datos ampliados, Fig. 10). Nos centramos en la fase en la que las bacterias están en contacto con los gusanos y consideramos una población homogénea. La dinámica del número de bacterias que viven en (cualquier) asociación de huéspedes n(t) puede describirse mediante la ecuación

donde W(t) denota la biomasa de lombrices en la placa en el momento t. Consideramos que al crecer hasta la saturación, las bacterias en la placa siempre están en exceso, de modo que sólo el número de gusanos y la velocidad f a la que se alimentan de bacterias limitan la inmigración de bacterias de vida libre al huésped. Suponemos un crecimiento logístico de la población bacteriana dentro de los gusanos, con una tasa máxima r y una capacidad de carga proporcional a la biomasa de los gusanos W(t) y la capacidad de carga K por unidad de biomasa del gusano. Finalmente, una fracción de la población asociada al huésped La población bacteriana se elimina del huésped a una velocidad δ, que abarca la muerte bacteriana y la expulsión al medio ambiente. Al igual que en el experimento de evolución, asumimos que solo se seleccionan las bacterias asociadas al huésped y continúan con el siguiente ciclo, ignorando la dinámica en la placa. Suponemos un crecimiento lineal para la biomasa de lombrices, W(t) = gt + W0, que abarca tanto la reproducción como el desarrollo. Despreciamos la posible evolución de los efectos beneficiosos sobre el crecimiento de los gusanos y fijamos los parámetros W0 = 10 yg = 711 d−1 a los valores observados experimentalmente.

Estudiamos cómo el número final de bacterias asociadas al huésped, nf, se ve afectado por cambios en los parámetros que describen el ciclo de vida bacteriano (r, δ, f, K). Definimos un rango de valores biológicamente plausibles para cada uno de estos parámetros (es decir, el espacio de rasgos) que se basan en datos experimentales cuando es posible:

10-1 d-1 < r < 101,25 d-1, es decir, entre una pequeña fracción y alrededor del doble de la tasa máxima de crecimiento en placa (~7 d-1).

10-0,5 d-1 < δ < 104 d-1, ya que el tiempo típico para que un gusano pierda el 50% de su microbioma (en ausencia de alimentación y replicación) debe oscilar entre segundos y días.

104 < K < 106,25, dados los órdenes de magnitud del número máximo de bacterias por gusano medido experimentalmente (~105).

103 d-1 < f < 107,5 d-1, ya que el tiempo típico para que un gusano vacío sea colonizado al 10% de su capacidad de carga (K = 105) debe variar entre segundos y días, sin tener en cuenta la liberación bacteriana y la replicación dentro del huésped. .

Para cada punto del espacio de rasgos, resolvimos numéricamente la ecuación (1) para calcular el número final esperado de bacterias en tf = 3,5 d, nf = n(tf). Finalmente, evaluamos la elasticidad de nf a lo largo de cada dirección del espacio de rasgos, que mide el cambio relativo esperado en nf con respecto a un pequeño cambio relativo en uno de los rasgos. Interpretamos el vector de las elasticidades como el gradiente de selección de los rasgos fenotípicos79 y utilizamos el elemento dominante de este vector para definir una "estrategia de evolución óptima"30 para cada punto del espacio de rasgos.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación sin procesar están disponibles en NCBI bajo Bioproject PRJNA862108. Se puede acceder a todos los demás datos en https://github.com/nobeng/c-di-GMP_host-association.

El código personalizado y los datos asociados están disponibles en https://github.com/nobeng/c-di-GMP_host-association.

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Descargar referencias

Agradecemos a E. Stukenbrock (Universidad de Kiel, Alemania) por el acceso al LSM 880; K. Guillemin (Universidad de Oregon, Eugene, Estados Unidos), P. Rainey (Instituto Max-Planck de Biología Evolutiva, Ploen, Alemania), H. Schweizer (Universidad del Norte de Arizona, Estados Unidos), F. Yildiz (Universidad de California Santa Cruz, Estados Unidos) y G. O'Toole (Dartmouth Medical School, Estados Unidos) por proporcionar cepas bacterianas o plásmidos; D. Rogers, J. Summers (ambos del Instituto Max-Planck de Biología Evolutiva, Ploen, Alemania) por su orientación en el intercambio alélico; J. Zimmermann (grupo Schulenburg, Universidad de Kiel, Alemania) por su apoyo bioinformático; B. Pees (grupo Schulenburg, Universidad de Kiel, Alemania) por su apoyo en la ilustración; S. Joel, J. Hofmann, J. Löwenstrom, J. Lorenzen, H. Griem-Krey, L. Bluhm y L. Rheindorf (todo el grupo Schulenburg, Universidad de Kiel, Alemania) por el apoyo de laboratorio; Kiel BiMo/LMB para acceder a sus instalaciones principales; el laboratorio de Schulenburg para recibir comentarios sobre el proyecto; y B. Bohannan (Universidad de Oregon, Eugene, Estados Unidos), R. Knight (Universidad de California, San Diego, Estados Unidos) y P. Engel (Université de Lausanne, Suiza) por su asesoramiento sobre el manuscrito. La financiación fue proporcionada por Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación), ID de proyecto 261376515 – SFB 1182, Proyectos A4 y Z3 (NO, AC, FB, JL, A. Tholey, A. Traulsen, H. Schulenburg); el proyecto DFG Research Infrastructure NGS_CC 407495230 (JF) como parte del proyecto Next Generation Sequencing Competence Network 423957469; la Escuela Internacional de Investigación Max-Planck en Biología Evolutiva (NO, AC); la Sociedad Max-Planck (beca a H. Schulenburg); y proyecto NIH R01AI168017 (MJGG, H. Sondermann).

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por Christian-Albrechts-Universität zu Kiel.

Thekla Schultheiss

Dirección actual: Instituto de Toxicología y Farmacología, Universidad de Kiel, Kiel, Alemania

Departamento de Genética y Ecología Evolutiva, Universidad de Kiel, Kiel, Alemania

Nancy Obeng, Anna Czerwinski, Daniel Schütz, Jan Michels, Thekla Schultheiss, Melinda Kemlein y Hinrichschulenburg

Departamento de Investigación Sistemática de Proteomas y Bioanálisis, Universidad de Kiel, Kiel, Alemania

John Leipert y Andrew Tholey

Instituto Max Planck de Biología Evolutiva, Plön, Alemania

Florencia Bansept, Arne Traulsen y Hinrichschulenburg

Centro CSSB de Biología de Sistemas Estructurales, Deutsches Elektronen-Synchrotron DESY, Hamburgo, Alemania

María J. García García & Holger Sondermann

Instituto de Biología Molecular Clínica, Universidad de Kiel, Kiel, Alemania

pie de janina

Sección de Biología, Universidad de Kiel, Kiel, Alemania

Holger Söndermann

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NO, AC, FB, A. Traulsen y H. Schulenburg conceptualizaron el proyecto. NO, AC, MJGG y H. Sondermann desarrollaron la metodología. NO, AC, JM, JL, TS, MK y JF realizaron investigaciones. Datos analizados de NO, AC, DS y FB. NO, AC, DS, JM, JL, FB, MJGG, TS, MK, JF, A. Tholey, A. Traulsen, H. Sondermann y H. Schulenburg contribuyeron a la redacción del manuscrito. NO, A. Tholey, A. Traulsen, H. Sondermann y H. Schulenburg supervisaron el proyecto. FB realizó modelaje.

Correspondencia a Hinrichschulenburg.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Microbiology agradece a Hassan Salem y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, b, Aptitud bacteriana durante el experimento de evolución. a, Aptitud bacteriana en el huésped a lo largo de los ciclos del experimento de evolución medida como unidades formadoras de colonias (UFC) por población de gusanos después de 3,5 días de exposición a Ce_MY316. b, En el control negativo, la aptitud bacteriana se evaluó en agar de crecimiento de nematodos en ausencia del huésped. Para cada punto de datos, se recolectaron bacterias en el momento del cuello de botella del ciclo observado. Las poblaciones replicadas (n = 6) se muestran como líneas finas separadas, y la media se muestra como una línea gruesa. c, UFC media por huésped individual en una población de gusanos para las poblaciones bacterianas evolucionadas del ciclo 10. Cinco larvas L4 de C. elegans proliferaron en céspedes bacterianos evolucionados o ancestrales durante 3,5 días (alcanzando la generación F1) y se extrajeron UFC de toda la población de gusanos. . Las UFC por población se dividieron por el número de gusanos en la población. En general, los resultados se muestran como diagramas de caja, con cajas que indican un 25% por encima y por debajo de la mediana, que se representa como la línea gruesa dentro de las cajas; las poblaciones replicadas (n=6) se indican como puntos de datos individuales. d, e, Cambios dinámicos en la composición del morfotipo durante la fase de vida libre del ciclo de vida asociado al huésped para poblaciones bacterianas desde el final del experimento de evolución. c, Resultados para las poblaciones replicadas del tratamiento de evolución asociado al huésped. Los diagramas de caja muestran la mediana (línea central), los cuartiles superior e inferior (límites de caja) y el rango intercuartil (bigotes). d, Resultados para las poblaciones replicadas del tratamiento de control. Se muestran las proporciones de los diferentes morfotipos de colonias (ver leyenda gráfica) a lo largo del ciclo de vida asociado al huésped. El punto de tiempo 0 está al final de la fase asociada al huésped, cuando las bacterias se transfieren a la fase de vida libre, que a su vez dura 168 horas. Se utilizaron regresiones beta corregidas por Fdr para predecir proporciones y probar un cambio en las proporciones a lo largo del tiempo (consulte la Tabla complementaria 2).

Micrografías de escaneo láser confocales (panel superior: sección óptica longitudinal; paneles inferiores: proyecciones de intensidad máxima que muestran secciones ópticas longitudinales) que revelan células bacterianas intactas (rojo) dentro del sistema intestinal de un adulto joven Ce_MY316 (cian). La micrografía superior muestra una descripción general del gusano completo y las micrografías inferiores muestran vistas detalladas de las secciones del gusano indicadas por los marcos discontinuos de arriba. Estos incluyen la faringe posterior con el molinillo de gusanos y el primer anillo intestinal (izquierda), el intestino central (centro) y la región anal (derecha). El panel inferior izquierdo es idéntico a la micrografía que se muestra en el texto principal (Fig. 1e). Barras de escala = 50 µm (descripción general) y 10 µm (vistas detalladas).

Se muestran los fenotipos de clones de morfotipo aislados de poblaciones independientes evolucionadas en huéspedes (izquierda) y poblaciones de control (derecha), incluidos morfotipos lisos, borrosos y arrugados. Los resultados para cada morfología se resumen como diagramas de caja (1

a, Análisis de componentes principales sobre las etapas características de la asociación huésped-hospedador para poblaciones bacterianas ancestrales, evolucionadas del huésped y evolucionadas de control. Los puntos de datos individuales se refieren a poblaciones replicadas coloreadas según el tratamiento de evolución (Tabla complementaria 5). b – f, Cambios en los fenotipos del ancestro bacteriano en las poblaciones evolucionadas para (b) colonización temprana, determinada por UFC extraídas de larvas L4 expuestas a bacterias durante 1,5 horas; (c) persistencia en larvas L4 mantenidas en tampón M9 durante 1 h (criadas en bacterias); (d) UFC de bacterias liberadas de larvas L4 en tampón dentro de 1 h (previamente cultivadas en bacterias de L1 a L4), (e) distancia de enjambre en agar al 0,5% dentro de 24; y (f) expansión de colonias en agar al 3,4% en 72 h. Todos los paneles muestran proporciones de poblaciones evolucionadas respecto a poblaciones ancestrales para cinco réplicas mostradas como puntos de datos individuales. La línea discontinua indica los valores medios obtenidos para la población ancestral. La diferencia entre los fenotipos evolucionados y ancestrales se evaluó mediante pruebas t unilaterales (corregidas por fdr; Tabla complementaria 8). En todos los diagramas de caja se muestran la mediana (línea central), los cuartiles superior e inferior (límites de caja) y el rango intercuartil (bigotes).

a, Cantidad de c-di-GMP intracelular medida con un sensor de fluorescencia. La intensidad de fluorescencia bruta (RFI) es la relación de TurboRFP (dependiente de c-di-GMP) y AmCyan (dependiente del número de copias del plásmido) y, por lo tanto, normalizada para el número de copias del plásmido sensor. b, c-di-GMP total determinado mediante análisis PRM de dilución isotópica. c, C-di-GMP determinado mediante análisis PRM de dilución de isótopos y normalizado por la cantidad total de proteína. En a, byc, se estudian los niveles de c-di-GMP para el ancestro y tres aislados arrugados del final del experimento de evolución, cada uno con una única mutación en wspF, wspE o rph. Comparamos los niveles de c-di-GMP en poblaciones de células replicadas (n = 5). d, c-di-GMP intracelular de aislados del final del experimento de evolución con morfología de colonia arrugada, suave y difusa medida con un sensor de fluorescencia (ANOVA anidado y prueba post hoc de Dunnett corregida por fdr; n = 5). e, RFI de los diferentes aislados normalizados por RFI ancestral para corregir los efectos dependientes de la replicación (ANOVA y prueba post hoc de Dunnett corregida por fdr; n = 5; Tabla complementaria 10. Para las mutaciones respectivas, consulte la Tabla complementaria 9). Los diagramas de caja muestran la mediana (línea central), los cuartiles superior e inferior (límites de caja) y el rango intercuartil (bigotes).

En la parte superior, las ilustraciones de los dominios proteicos muestran la organización de WspF, WspE y la ribonucleasa PH con los sitios afectados por la mutación Pl_MYb11 resaltados por flechas rojas. A continuación, se muestran las alineaciones de secuencias de proteínas de proteínas ancestrales y evolucionadas con los dominios resaltados en los mismos colores que arriba.

a, Formación de biopelículas de mutantes wspF, wspE y rph en comparación con Pl_MYb11 (mediana ancestral = línea discontinua) después de dos días agitando placas de microtitulación de incubación. Ilustración de biopelículas con fotografías de biopelículas extraídas de tubos de ensayo después de 48 h de incubación. Barras de escala = 4 mm. b, motilidad de enjambre y c, expansión de colonias de los aislados wspF, wspE y mutantes rph se compararon con Pl_MYb11 (mediana ancestral = línea discontinua) después de 24 y 72 h, respectivamente. bc, barras de escala = 0,5 cm. ac, Los experimentos se realizaron con min. 3 réplicas/tratamiento y se analizaron con ANOVA y pruebas post-hoc de Dunnett corregidas por fdr o una prueba t unilateral. Los diagramas de caja muestran la mediana (línea central), los cuartiles superior e inferior (límites de caja) y el rango intercuartil (bigotes). d, Macrocolonias de Pl_MYb11 ancestral y tres aislados arrugados del final del experimento de evolución (con mutaciones únicas en wspF, wspE o rph). e, Macrocolonias de mutantes ΔwspR en el fondo Pl_MYb11 wspF, wspE o rph. f, Macrocolonias de aislados wspF, wspE o rph que expresan la fosfodiesterasa PA2133 del plásmido, Pl_ MYb11 que expresa la diguanilato ciclasa constitutivamente activa GCN4-WspR del plásmido y controles de vector vacíos. df, las macrocolonias se cultivaron en agar de soja tríptico suplementado con rojo Congo durante uno (d,e) a tres (f) días. Barras de escala = 1 mm.

Tres morfotipos coevolucionados aislados de la población replicada T3 evolucionada por el huésped se emparejaron con el ancestro. En un cuarteto estaba presente el mutante wspF arrugado (MT12) y en el otro el mutante wspE arrugado (MT14). Los puntos de datos representan réplicas independientes, mín. 3 réplicas por tratamiento. Las diferencias entre morfotipos y ancestros se evaluaron utilizando un modelo lineal mixto y posteriores comparaciones post-hoc de Dunnett corregidas por fdr; consulte la Tabla complementaria 13. Los diagramas de caja muestran la mediana (línea central), los cuartiles superior e inferior (límites de caja) y el rango intercuartil (bigotes).

Distribución de longitudes de secuencia y porcentajes de identidades de los resultados de BLAST para genes individuales. La proporción de resultados de BLAST que pertenecen a una longitud de secuencia particular y clases de identidad porcentuales se muestran como tonos azules con intensidad variable (consulte la escala). Los rectángulos rojos muestran las áreas para las cuales se supone la presencia del gen considerado y se configuraron para incluir los valores de acierto BLAST más grandes tanto en la longitud máxima de secuencia como en el porcentaje de identidades.

a, Definición de las tasas para el modelo de un linaje microbiano que es absorbido, replicado dentro y expulsado de gusanos en un plato. b, Distribución de las estrategias óptimas en todo el espacio de rasgos. c, Proyección del espacio de rasgos sobre los ejes (r, δ). Para cada punto del mapa, el color representa las proporciones de veces que cada una de las 4 estrategias posibles es óptima, integrándose sobre los valores de f y K. El esquema de color utiliza el código de color CMYK: un cian puro (respectivamente magenta, amarillo) El píxel indica que la única estrategia óptima para los valores considerados (r, δ) es ↓ δ (respectivamente ↑ f, ↑K). Un color de un tono más oscuro indica que ↑ r también es óptimo en una pequeña proporción en ese punto, como se muestra en las escalas de color adicionales para cada borde.

Tablas complementarias 1 a 22.

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Obeng, N., Czerwinski, A., Schütz, D. et al. El c-di-GMP bacteriano tiene un papel clave en el establecimiento de la simbiosis huésped-microbio. Microbiol natural (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01468-x

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Recibido: 21 de septiembre de 2022

Aceptado: 10 de agosto de 2023

Publicado: 31 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01468-x

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