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Jul 22, 2023

Entrega dirigida de un PD

BMC Medicine volumen 21, Número de artículo: 327 (2023) Citar este artículo 231 Accesos 1 Detalles de Altmetric Metrics CD133 se considera un marcador de células madre cancerosas (CSC) en varios tipos de tumores,

BMC Medicine volumen 21, número de artículo: 327 (2023) Citar este artículo

231 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

CD133 se considera un marcador de células madre cancerosas (CSC) en varios tipos de tumores, incluido el carcinoma hepatocelular (CHC). Las células T específicas del receptor de antígeno quimérico (CAR-T) que se dirigen a las CSC positivas para CD133 han surgido como una herramienta para el tratamiento clínico del CHC, pero la inmunogenicidad, el alto costo de los vectores virales recombinantes de grado clínico y la posible mutagénesis por inserción limitan su aplicación clínica. .

Se construyeron células CAR-T específicas de CD133 que secretan scFv bloqueador de PD-1 (células CD133 CAR-T y PD-1 s) utilizando un sistema de transposones de la bella durmiente de la tecnología minicircle, y se determinó la eficacia antitumoral de CD133 CAR-T y PD-1. Las células de s se analizaron in vitro e in vivo.

Un análisis univariado mostró que la expresión de CD133 en pacientes masculinos en la etapa tardía (II y III) se asoció significativamente con una peor supervivencia libre de progresión (SSP) (P = 0,0057) y supervivencia general (SG) (P = 0,015), y una El análisis multivariado mostró una tendencia hacia una peor SG (P = 0,041). Los pacientes masculinos con CHC avanzado exhibieron una puntuación positiva combinada (CPS) de PD-L1 aproximadamente 20 veces mayor en comparación con aquellos con CHC en una etapa temprana. Generamos con éxito células CD133 CAR-T y PD-1 s que podrían secretar scFv bloqueador de PD-1 basándose en un sistema de bella durmiente que involucra vectores de minicírculo. Las células CD133 CAR-T y PD-1 s exhibieron una actividad antitumoral significativa contra el CHC in vitro y en modelos de ratón con xenoinjerto. Por lo tanto, las células CD133 CAR-T y PD-1 pueden ser una estrategia terapéuticamente manejable para atacar las CSC positivas para CD133 en pacientes masculinos con CHC avanzado.

Nuestro estudio proporciona una estrategia no viral para construir células CAR-T que también podrían secretar inhibidores de bloqueo de puntos de control basados ​​en un sistema de la Bella Durmiente a partir de vectores de minicírculo y reveló un beneficio potencial de esta estrategia para pacientes masculinos con CHC avanzado y alta expresión de CD133 (puntuación media de inmunohistoquímica). > 2.284).

Informes de revisión por pares

El carcinoma hepatocelular (CHC) es la neoplasia maligna primaria del hígado más común y la tercera causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo [1]. A pesar de la evaluación de muchas quimioterapias y agentes terapéuticos dirigidos, los únicos tratamientos probados para la enfermedad avanzada son sorafenib, regorafenib y lenvatinib, y los beneficios de supervivencia general son modestos [2]. Recientemente, dos inhibidores de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1), pembrolizumab [3] y nivolumab [4], fueron aprobados para el tratamiento del CHC en pacientes que experimentaron progresión después de tomar sorafenib, pero sus tasas de respuesta (aproximadamente 20%) también fueron insatisfactorio [5]. Por lo tanto, se necesita con urgencia una nueva estrategia de tratamiento que mejore los beneficios clínicos del CHC.

La recurrencia y la metástasis son eventos frecuentes y esperados después de la terapia sistémica en pacientes tratados con los tratamientos actuales para el CHC avanzado. La evidencia emergente sugiere que la mayoría de las terapias sistémicas solo pueden disminuir la carga tumoral primaria porque las células madre cancerosas (CSC) poseen mecanismos intrínsecos para resistir la terapia tradicional o novedosa, y las CSC en reposo son responsables del inicio, la recurrencia y la metástasis del tumor [6, 7]. Junto con la presencia de células similares a células madre de CHC positivas para CD133 [8], un número creciente de estudios indican que la expresión de CD133 se correlaciona con tumores en estadios más avanzados y mal pronóstico en pacientes con CHC [9, 10], lo que sugiere una estrategia prometedora de utilizando CD133 como objetivo para el tratamiento del CHC. Las células T específicas del receptor de antígeno quimérico (CAR-T) que se dirigen a las CSC positivas para CD133 han surgido como una herramienta para el tratamiento clínico del CHC (NCT02541370).

La terapia inmune basada en células CAR-T para el cáncer se basa en la integración estable de un transgén en el genoma del huésped para que la progenie genéticamente modificada infundida pueda proporcionar efectos terapéuticos a largo plazo. Hasta la fecha, la mayoría de las terapias con células CAR-T se producen mediante sistemas de vectores virales tradicionales que se han utilizado de manera amplia y segura para insertar transgenes en células T, pero la inmunogenicidad, el alto costo de los vectores virales recombinantes de grado clínico y el potencial de mutagénesis por inserción limitan su aplicación clínica [11, 12]. Los sistemas de transferencia de genes no virales son alternativas atractivas a los métodos actuales para producir células CAR-T. Las alternativas más comunes a los vectores virales son los transposones. Se ha informado sobre una variedad de sistemas basados ​​en transposones para la producción de células CAR-T, y estos sistemas proporcionan una menor inmunogenicidad, perfiles de seguridad mejorados y costos reducidos para la fabricación GMP de células CAR-T. De las tecnologías disponibles actualmente en ensayos clínicos, el sistema de transposones de la bella durmiente (SB) ha experimentado el desarrollo más rápido desde su inicio hasta su aplicación en humanos [13]. Los minicírculos (MC) son vectores de ADN superenrollados que constituyen una nueva alternativa a los plásmidos como fuentes de transposasas y transposones SB. En comparación con los plásmidos convencionales, los MC carecen de secuencias estructurales bacterianas y genes de resistencia a los antibióticos, lo que da como resultado niveles más altos y estables de expresión genética transitoria cuando se transfectan en células de mamíferos [14, 15].

En este artículo, describimos un protocolo para generar células CAR-T específicas de CD133 que secretan PD-1 que bloquea el fragmento variable monocatenario (scFv) dirigido a células HCC utilizando un sistema de modificación genética no viral basado en SB que involucra vectores donantes de transposones MC para simplificar la Protocolo actual de producción de células CAR-T. Nuestro objetivo era utilizar nuestra plataforma de células CAR-T específica de CD133 para crear una terapia única contra el CHC avanzado en la que el scFv bloqueador de PD-1 se administraría localmente en el sitio del tumor para minimizar la toxicidad.

Para la tinción inmunohistoquímica (IHC), se obtuvieron 67 muestras de pacientes con carcinoma hepatocelular (CHC), que consistían en tejidos adyacentes no cancerosos y tejidos tumorales de CHC, de pacientes sometidos a resección primaria de CHC en el Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen entre 2005 y 2008. Estos pacientes no recibieron ninguna quimioterapia o radioterapia preoperatoria. Además, el estudio incluyó 26 casos de metástasis pulmonares, recopilados de pacientes que se sometieron a resección de metástasis pulmonares en el mismo centro entre 2003 y 2021.

Todas las muestras humanas utilizadas en el estudio fueron materiales archivados obtenidos con el consentimiento informado de los pacientes. El uso de estas muestras fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de SYSUCC (Aprobación No. GZR2019-287).

Los plásmidos utilizados en este estudio fueron clonados de forma personalizada por vectorbuilder.com. Se utilizaron los siguientes vectores de expresión del gen transposón SB:

pSB-EF1alfa-antiCD133 CD8 4-1BB CD3z-P2A-PD-1 bloqueante scFv-WPRE-BGH poliA

El scFv anti-CD133 derivado de HW350341.1 en un estudio previo [16] se expresa bajo el control del promotor alfa EF1. Para evaluar la eficiencia de la transferencia de genes y la secreción de scFv bloqueador de PD-1, insertamos una etiqueta c-Myc (GAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAGGATCTG) entre el scFv CD133 y el CD8TM y al final del scFv bloqueador de PD-1, respectivamente. El scFv bloqueador de CD133 CAR y PD-1 se unieron mediante una secuencia peptídica P2A. Para aumentar la expresión genética, colocamos un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE) entre el codón de parada y la señal poliA de la hormona del crecimiento bovino (BGH). Las repeticiones terminales invertidas (ITR) con unión específica a la transposasa SB identificadas en un estudio anterior [17] se colocaron antes de EF-1α y al final de BGH poliA. La secuencia de pSB-EF1alfa-antiCD133 CD8 4-1BB CD3z-P2A-PD-1 que bloquea scFv-WPRE-BGH poliA también se adjuntó como en el archivo adicional 1.

pSB-EF1alfa-antiCD133 CD8 4-1BB CD3z -WPRE-BGH poliA

Para comparar la eficacia de las células CAR-T anti-CD133 y las células CAR-T anti-CD133 que secretan scFv bloqueador de PD-1, también construimos células CAR-T anti-CD133 con la misma estructura descrita en (1) sin el PD- 1 scFv de bloqueo.

Promotor pSB-CMV-intrón SV40-señal poli(A) SB100 × -SV40

pCMV(CAT)T7-SB100 se adquirió de Addgene (número de catálogo 34879). Utilizamos recombinación homóloga promotor CMV-intrón SV40-SB100 × -SV40 poli (A) en sitios MCS en un vector de clonación de minicírculo parental (pMC. BESPX-MCS2, número de catálogo MN100B-1, System Biosciences).

pMC.BESPX-MCS2

pMC.BESPX-MCS2 es un vector de clonación de minicírculo parental vacío (número de catálogo MN100B-1, System Biosciences), que se utilizó para producir minicírculos a partir de transposones y transposasas.

Cepa de producción de minicírculo

ZYCY10P3S2T E. coli (número de catálogo MN900A-1, System Biosciences) fue la célula competente utilizada para la producción de minicírculos.

Primero clonamos el transposón SB pSB-EF1alpha-antiCD133 CD8 4-1BB CD3z-P2A-PD-1 que bloquea scFv-WPRE-BGH poliA, pSB-EF1alfa-antiCD133 CD8 4-1BB CD3z-WPRE-BGH poliA y SB100 × transposasa en los sitios MCS del vector de clonación del minicírculo parental (pMC.BESPX-MCS2), agregaron 200 ng del plásmido en un vial de ZYCY10P3S2T E. coli girando suavemente la punta de la pipeta a través de las células mientras se dispensaba, se incubó en hielo durante 30 minutos. Se sometió a un choque térmico las células durante 30 s en un baño de agua a 42 ° C y luego se colocaron las células en hielo durante 2 minutos. Agregamos 0,2 ml de medio SOC a temperatura ambiente, transfirimos la muestra a un tubo de cultivo bacteriano e incubamos las células con agitación a 250 rpm (37 °C) durante 60 min. Luego se esparcieron placas de cultivo LB precalentadas para la selección de kanamicina (50 µg/ml de kanamicina) con 50–200 µl de bacteria. Las células se incubaron durante la noche a 37 °C. Luego, se recogieron de 3 a 5 colonias y se cultivaron en 2 ml de LB que contenía 50 μg/ml de kanamicina. Las células se cultivaron durante la noche, el plásmido se extrajo mediante miniprep y se evaluó el plásmido parental en minicírculo.

Se recogió una sola colonia en 2 ml de LB que contenía 50 μg/ml de kanamicina y luego se incubó a 30 °C con agitación a 250 rpm durante 4 a 6 h. Luego, se agregaron de 0,5 a 1 ml a 200 ml de medio de crecimiento 1x. Las placas se volvieron a colocar en una incubadora a 30 °C con agitación a 250 rpm durante la noche.

Después del crecimiento durante la noche, se midieron el pH y la DO600 del medio de cultivo. El pH objetivo era aproximadamente 7 y la DO600 objetivo era 4-6. Luego, se combinaron 400 ml del cultivo nocturno con 400 ml de medio de inducción 1x (400 ml de medio LB fresco, 16 ml de hidróxido de sodio 1 N y 0,4 ml de L-arabinosa al 20%). La mezcla se incubó nuevamente a 32 °C y se agitó a 250 rpm durante 5 h. El tiempo total de inducción fue de 5 h. Se usó un mililitro del cultivo bacteriano para realizar una minipreparación, seguido de un análisis de digestión de restricción para verificar la calidad del plásmido del minicírculo. Las bacterias se sedimentaron a 4 °C y el sedimento se almacenó a -80 °C.

Se utilizó un kit de extracción de plásmido libre de endotoxinas (número de catálogo DP117, TIANGEN) para extraer el plásmido del sedimento bacteriano. Luego, se cortó el plásmido utilizando el sitio de restricción SalI para evaluar si el minicírculo se indujo con éxito. El tamaño del minicírculo era más pequeño que el del plásmido original y no hubo contaminación del plásmido original.

Las PBMC se obtuvieron de voluntarios y las capas leucocitarias se obtuvieron de MD Pacific Cell Separation Media (MD Pacific, Tianjin, China). Después de la lisis de eritrocitos (Beyotime, China), las células T se aislaron utilizando el kit de aislamiento de células T Pan (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania). Luego, las células T se activaron mediante estimulación con perlas anti-CD3/CD28 (Stemcell, EE. UU.) durante la noche. La transfección de vectores de transposón y transposasa en 1 x 107 células T se realizó el día 2 con un 4D-Nucleofector de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Lonza, Colonia, Alemania). La electroporación se realizó con el kit L Amaxa™ P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X (24 RCT). Brevemente, se suspendieron 1 x 107 células en 100 μl de tampón de nucleofección que contenía las cantidades indicadas de transposón y ADN del vector de transposasa. Se aplicó el programa E0-115 y las células se suministraron inmediatamente con 3 ml de medio (X-vivo) con 1000 UI/ml de cultivo de interleucina (IL)-2, IL-7 e IL-15 humana recombinante durante 2 a 3 días. . Cuarenta y ocho a setenta y dos horas después de la electroporación, las células se resuspendieron en 2 ml de medio fresco (X-vivo) con 400 UI/ml de interleucina (IL)-2 humana recombinante (Four Rings Biopharmaceutical, Beijing, China) y se expandieron con Antígeno proteico recombinante CD133 (R andD Systems, EE. UU.) y CD28 durante 2 a 3 días. Las células CAR-T positivas se evaluaron mediante citometría de flujo a través de c-Myc-tag, se enriquecieron con c-Myc-tag conjugado con biotina (CST, EE. UU.) y perlas de anti-biotina (Miltenyi, Alemania) y se expandieron hasta 21 ~ 28 días. La concentración de IL-2 se redujo a 40 UI/ml 3-4 días antes del análisis funcional.

Se generaron reservas lentivirales mediante transfección de células T 293 con los plásmidos pMD2.G y pSPAX (Addgene) de luciferasa, blasticidina y puromicina. Para la transferencia de genes lentivirales a líneas de células tumorales, se agregaron 20 µl de lentivirus a las células tumorales. Dos días después de la infección, las células tumorales positivas se seleccionaron utilizando blasticidina. Para la transferencia de genes lentivirales a células T, se utilizó una MOI de 10 para infectar células T primarias de voluntarios. Después de clasificar con puromicina, las células T PD + 1 se evaluaron mediante citometría de flujo.

Los portaobjetos de montaje se incubaron a 65 °C durante 2,5 h, se hidrataron, se repararon en H2O2 al 3%, se bloquearon en suero de cabra, se incubaron con el anticuerpo primario contra CD133 (Invitrogen, número de catálogo PA5-82,184, dilución 1:250) y luego incubado con el anticuerpo secundario (Dako, Agilent). Las diapositivas se escanearon a través de un escáner de la sección de patología digital (KFBIO, Ningbo, China) para obtener un escaneo completo. La vista amplificada fue fotografiada bajo un microscopio (Nikon Eclipse Ni-U).

La puntuación semicuantitativa se realizó de la siguiente manera: 0 para teñir en ≤ 1 % de las células cancerosas, 1 para teñir entre el 2 y el 25 % de las células cancerosas, 2 para teñir entre el 26 y el 50 % de las células cancerosas, 3 para teñir entre el 51 y el 75 % de células cancerosas y 4 para teñir en ≥ 75% de las células cancerosas. La intensidad de la tinción se calificó de la siguiente manera: 0, sin tinción; 1, tinción débil; 2, tinción moderada; y 3, tinción fuerte.

La expresión del ligando de muerte programada 1 del tumor (PD-L1) se evaluó utilizando un clon de anticuerpo SP142 de inmunohistoquímica (IHC) de PD-L1 (Abcam, 228,462) y una puntuación positiva combinada (CPS). CPS, que es un método de puntuación de PD-L1 altamente reproducible para múltiples tipos de tumores [18, 19], se obtiene sumando el número de células teñidas con PD-L1 (células tumorales, linfocitos, macrófagos), dividiendo el resultado por el total. número de células tumorales viables y multiplicado por 100 y CPS/área tumoral completa según la siguiente fórmula:

Para evaluar si las células CAR-T se infiltraron en tumores sólidos, se utilizó un anticuerpo CD3 (número de catálogo ZM-0417–6.0, OriGene, solución de trabajo) para evaluar si las células T se habían infiltrado en tumores sólidos.

Se utilizó citometría de flujo para determinar la eficiencia de transducción de las células transducidas después de la tinción con c-Myc-tag conjugado con PE (CST, clon 71D10), 7AAD y CD3 antihumano de conejo conjugado con APC-Cy7 (BD Biosciences, clon SK7, APC-Cy7). Los datos de las células se recogieron utilizando un citómetro de flujo Beckman Coulter Gallios y se analizaron utilizando CytExpert (Beckman). Para el análisis de células CAR-T en el experimento in vitro, se utilizaron los siguientes anticuerpos y reactivos para citometría de flujo para distinguir las células T vírgenes, T efectoras, T de memoria central y T de memoria efectoras: APC-Cy7 CD3 antihumano, PE anti c-Myc-tag (CST, clon, 71D10), APC-CD8 (BD, clon, HIT8α), FITC-CD45RA (BD, clon, L48) y PECy7-CCR7 (BD, clon, 3D12). Se utilizaron los siguientes anticuerpos para evaluar las frecuencias de Tregs entre las células T CD4 en el experimento in vitro: APC-Cy7 anti-CD4 humano (BD, clon, RPA-T4), APC anti-CD25 humano (BD, clon, M- A251) y FITC anti-Foxp3 humano (BioLegend, clon, 206D).

Para evaluar la incubación de células CAR-T y Hep3B, se utilizaron APC-Cy7-CD3 y PE-CD133 (Miltenyi, clon, REAL803) para distinguir las células CAR-T y Hep3B. Se usó PD-1-APC (BD, clon, MIH4) para evaluar la expresión de PD-1. Para evaluar el efecto espectador de scFv que bloquea PD-1, se usó PE etiquetado con c-Myc para evaluar el sobrenadante de células CD133 CAR-T y PD-1 s incubadas con células T PD-1 +, como anti- El anticuerpo c-Myc-tag puede unirse al scFv bloqueador de PD-1.

Para evaluar la expresión de CD107a, se agregaron al medio células CAR-T incubadas con Hep-3B, el anticuerpo CD107a (BD, clon, H4A3) y un cóctel de activación de leucocitos con BD GolgiPlugTM (BD) y monensina (BioLegend) antes del análisis de 4 h.

Para evaluar si el scFv PD-1 podría restaurar la función de las células T PD-1+, se usó FVS780 (BD, células vivas/muertas) para excluir las células muertas. Después de lavar con PBS, las células se tiñeron con CD3 PE (BD, clon, HIT3α). La tinción intracelular para Granzyme B BV421 (BD, clon, GB11) y TNFα APC (BD, clon, MAb11) finalmente se realizó según el protocolo del fabricante (BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation/Permeabilization Solution Kit, n.º 554714).

Para evaluar las células T que se infiltraron en el entorno del tumor, el tumor se picó con una hoja de afeitar lo más finamente posible; posteriormente, se digirió con colagenasa I y IV (Yeason: #40507ES60 y #40510ES60), dispasa II (Yeason: #40104ES80) y DNasa I (Yeason: #10607ES15) en medio 1640 durante 1 h para producir células individuales. Los glóbulos rojos se lisaron y luego se sometieron a CD3 APC (BD, clon, UCHT1) y tinción con FVS780 vivo/muerto.

Se realizaron ensayos de citotoxicidad continua con células CAR T utilizando un sistema xCELLigence Real-Time Cell Analyzer-Multiple Plate (Agilent Technologies). En resumen, se agregaron 11.000 células Hep-3B a cada pocillo de una placa de 16 pocillos (Agilent, n.º 20220922). Después de aproximadamente 24 h, se agregaron las células CAR positivas correspondientes en diferentes proporciones de efector a objetivo (E:T). Los valores del índice celular, que representan cambios en la impedancia eléctrica y reflejan el número de células objetivo supervivientes en superficies de microelectrodos biocompatibles, se calcularon utilizando el software RTCA cada 15 minutos. Los datos del índice celular de cada grupo representan el valor medio de 4 pocillos.

Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) en tiempo real para evaluar los niveles de expresión de los genes de fusión CAR de acuerdo con un protocolo descrito previamente. Se amplificó un fragmento de 153 pb (par de bases) que contenía porciones de la cadena α de CD8 y la cadena CD137 adyacente utilizando un cebador directo 5′-GGTCCTTCTCCTGTCACTGGTT-3' y un cebador inverso 5′-TCTTCTTCTTCTGG AAATCGGCAG-3' para detectar el gen CAR; La amplificación de GAPDH se utilizó como control interno y para la normalización de las cantidades de ADN. La qPCR se realizó utilizando el kit Fast All-in-One RT con SYBR Green Master Mix (ES Science) y se ejecutó en un LightCycler 480 (Roche).

Para demostrar que las células CD133 CAR-T y PD-1 s pueden secretar scFv bloqueador de PD-1, las células CAR-T se centrifugaron a 2000 × g durante 20 minutos a 4 ° C. Luego, el sobrenadante de las células Mock T, CD133 CAR-T y CD133 CAR-T y PD-1 s se concentró utilizando un sistema Millipore (10 kd), con centrifugación a 4000 g durante 15 a 20 min hasta que el líquido restante se diluyó. aproximadamente 200 µl. Luego, se añadió RIPA (Sigma) que contenía inhibidor de proteasa en hielo durante 15 minutos y se detectó el scFv bloqueador de PD-1 usando un anticuerpo de conejo anti-c-Myc-tag (CST, Cat 14,038, 1:1000). La detección del anticuerpo se logró con el sustrato de transferencia Western Pierce ECL (Tanon). Para detectar si los genes CAR se integraron en las células T, se detectaron CD3 zeta y exo-CD3zeta endógenos utilizando anti-CD3 ζ (Santa Cruz Biotechnology, Clone 6B10.2, 1:200).

Los sobrenadantes de células T simuladas, células CD133 CAR-T y células CD133 CAR-T y PD-1 incubadas con células tumorales en una proporción de 1:1 durante 24 h se recogieron y almacenaron a -80 °C. Luego se descongeló el sobrenadante y se detectaron las concentraciones de IFNγ, TNFα e IL-2 según los protocolos del fabricante (Dakewe Biotech).

Las células T PD-1+ construidas con el lentivirus se lavaron con PBS frío 2 a 3 veces y se usaron puntas para colocar las células T en un portaobjetos. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4%, se lavaron con PBS, se permeabilizaron con Triton X-100 al 1% durante 10 min a temperatura ambiente, se bloquearon con suero de cabra durante 30 min, se lavaron con PBS, se incubaron con anti-c-Myc-tag- 647 directamente o se incubaron con el sobrenadante condensado de células CD133 CAR-T y PD-1 s, y luego se incubaron con c-Myc-tag-647. La fluorescencia se evaluó utilizando una Nikon Eclipse Ti2.

Todos los experimentos se realizaron de conformidad con todas las regulaciones éticas relevantes y de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (No. 18080B). Se inocularon por vía subcutánea ratones NCG (GuangDong GemPharmatech Co., Ltd.) de 4 a 6 semanas de edad con 2,5 × 106 células tumorales (Hep-3B-luc) y, después de que el tumor creciera hasta 50-100 mm3, Mock T, CD133 CAR- Se inyectaron por vía intravenosa células T y CD133 CAR-T y PD-1 en ratones NCG con Hep-3B. Para los modelos de ratones metastásicos, a los ratones NCG se les inyectaron por vía intravenosa 2,5 millones de células Hep3B-luc. La metástasis se confirmó mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI) y luego se trató con una inyección en el velo de la cola de 5 millones de células Mock T, CD133 CAR-T o CD133 CAR-T y PD-1 s. BLI del crecimiento tumoral se realizó utilizando un sistema de imágenes PerkinElmer IVIS con el software Living Image. Finalmente, se evaluó el peso del tumor. Los ratones fueron sacrificados cuando el volumen del tumor alcanzó los 2000 mm3 o cuando mostraron algún signo de enfermedad. Para establecer un modelo tumoral de xenoinjerto in situ, se inyectaron directamente 2,5 millones de células Hep3B-luc en el hígado de ratones NCG. El tumor fue confirmado por BLI y se inyectaron 5 millones de células Mock T, CD133 CAR-T o CD133 CAR-T y PD-1 en la vena de la cola. BLI del crecimiento tumoral se realizó utilizando un sistema de imágenes PerkinElmer IVIS con el software Living Image.

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., versión 8.02) y SPSS (IBM, versión 25.0), excepto las curvas de supervivencia, que se generaron mediante el método de supervivencia de Kaplan-Meier y se compararon con la prueba de rangos logarítmicos. utilizando el lenguaje de programación R. Se utilizaron pruebas t no pareadas de dos colas para comparaciones de 2 grupos. Se utilizó ANOVA unidireccional para comparaciones de 3 o más grupos en una sola condición. Los factores que predicen la SG y la SSP se evaluaron mediante análisis univariados y multivariados del modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas de la siguiente manera: *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001.

Para evaluar la idoneidad de CD133 como objetivo para la terapia con células CAR-T en CHC, primero analizamos los niveles de proteína CD133 en 67 muestras de pacientes con CHC (estadio I, 36 casos; estadio II, 7 casos; estadio III, 24 casos; estadio IV , 26 casos de metástasis pulmonar) y tejido adyacente compatible mediante ensayo IHC. La expresión de CD133 se clasificó en cuatro niveles, negativa (0), débil (menos de 5), moderada (5-10) y fuerte (más de 10) (Fig. 1A), y se dividió en CD133-alta o CD133-. expresión baja utilizando la puntuación IHC mediana (2,284). Se pudo detectar una alta expresión de CD133 en 19/67 (28,36%) tejidos primarios de CHC, con 8/36 (22,22%) en estadio I, 11/31 (35,48%) en estadios II y III y 13/26 (50,00% ) en la etapa de metástasis pulmonar (Fig. 1B). El análisis estadístico reveló que CD133 se correlacionó significativamente con la invasión de la vena porta y la AFP (P = 0,002 y P = 0,016 respectivamente; archivo adicional 2: Tabla S1). No hubo una asociación significativa entre la expresión de CD133 y la edad, el sexo, el HBsAg, la cirrosis hepática, el tamaño del tumor, el número del tumor, la encapsulación del tumor, la diferenciación histológica, el estadio TNM o la invasión microvascular (archivo adicional 2: Tabla S1). A continuación, analizamos el impacto de los niveles de expresión de la proteína CD133 en la supervivencia de los pacientes con CHC. Aunque no hubo una asociación significativa entre la expresión de CD133 y la SG o la SSP) en todos los pacientes (archivo adicional 2: Fig. S1A, Tabla S2), la expresión de CD133 en la etapa tardía (II y III) en pacientes masculinos se asoció significativamente con la SSP ( P = 0,0057) y peor OS (P = 0,015) en el análisis univariante (Fig. 1C y archivo adicional 2: Tablas S3, S4), con una tendencia hacia una peor OS en el análisis multivariado (P = 0,041) (archivo adicional 2: Tabla S4). Además, los datos de TCGA en línea (https://www.proteinatlas.org/ENSG00000007062-PROM1/pathology/liver+cancer) para HCC también mostraron que la expresión de CD133 en pacientes masculinos o en etapa tardía se correlacionaba con una peor SG (archivo adicional 2: Fig. .S1B). Estas características hacen de la proteína CD133 un objetivo razonable para la inmunoterapia en pacientes masculinos con CHC avanzado. Para evaluar si los pacientes masculinos con CHC avanzado también se beneficiarán de la terapia de bloqueo del punto de control PD-1, también evaluamos la expresión de PD-L1 en pacientes masculinos con CHC utilizando el método CPS. Se utilizaron un total de 57 portaobjetos (Etapa 1, Etapas 2 y 3 y metástasis pulmonares, 19 portaobjetos de cada etapa) para evaluar la expresión de PD-L1. Se encontraron puntuaciones CPS significativamente más altas para las metástasis y las muestras de las etapas II y III en comparación con las muestras de la etapa I (P = 0,0024 y P = 0,0356, respectivamente; Fig. 1D, E), lo que indicó que los pacientes masculinos con CHC avanzado pueden beneficiarse de Terapia de bloqueo del punto de control PD-1/PD-L1.

Imagen representativa de la detección de CD133 y PD-L1 en diferentes etapas en pacientes con CHC. Imágenes A HE y la correspondiente expresión de CD133 en tejido tumoral primario en pacientes con cáncer de hígado y metástasis pulmonares. B El porcentaje de expresión de CD133 en tumores primarios en estadios tempranos (estadio I) y avanzados (estadios II y III) y metástasis en el pulmón. C Curva de Kaplan-Meier que representa análisis de supervivencia en pacientes masculinos en estadio II y III. El valor de P se calculó mediante la prueba de rangos logarítmicos. D Imagen representativa de la expresión de PD-L1 en diferentes etapas y en metástasis pulmonares de pacientes con CHC. E La expresión de PD-L1 en diferentes etapas y en metástasis pulmonares de pacientes con CHC se evaluó utilizando el método de puntuación CPS y se comparó. Media ± DE, n = 19, prueba t de Student no apareada de dos colas, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, ns, no significativo

A continuación, se construyeron células CAR-T específicas de CD133 que secretan el anticuerpo scFv bloqueador de PD-1. Utilizamos un sistema de modificación genética no viral basado en SB que involucra vectores donantes de transposones MC para simplificar el protocolo actual de producción de células CAR-T. La transposasa codificada por MC se preparó cortando SB100 de pCMV (CAT)T7-SB100 e insertándolo en el sitio de clonación MCS de un vector de clonación MC parental (pMC.BESPX-MCS2). El transposón codificado por MC se preparó mediante dos vectores de transposón que expresan CD133-CAR o CD133-CAR optimizado y scFv bloqueador de PD-1 con marcadores de transducción c-Myc y se insertó en el sitio de clonación MCS de pMC.BESPX-MCS2 (Fig. 2A). . Estos plásmidos que contienen transposasa y transposones codificados por MC se recombinaron con L-arabinosa para la producción de MC, lo que resultó en una reducción del tamaño del vector (Fig. 2B). Después de transfectar vectores de transposón y transposasa en dos proporciones (3:1 y 1:1) en células T de sangre periférica de donantes sanos, encontramos que una proporción de 1:1 tenía una mejor eficiencia de transfección y viabilidad celular. En los días 5 a 10, observamos un injerto de CAR de células T de 5 a 9% con CD133-CAR o CD133-CAR y scFv bloqueador de PD-1 mediante electrotransfección (Fig. 2C), y la viabilidad celular fue superior al 75%, según lo evaluado. mediante tinción con 7-AAD (n = 3) (Fig. 2D). Una proporción de 3:1 resultó en una menor viabilidad celular y las células no pudieron persistir en un cultivo a largo plazo (archivo adicional 2: Fig. S2A-C). La eficiencia de la transfección se mantuvo o aumentó durante más de 28 días (Fig. 2E). Para demostrar que PD-1 bloquea la secreción de scFv por células CAR-T específicas de CD133, se recogió y analizó el sobrenadante concentrado de células T modificadas mediante transferencia Western. Descubrimos que solo las células T transfectadas con CD133-CAR y scFv bloqueador de PD-1 podían secretar el scFv bloqueador de PD-1 (Fig. 2F). En conjunto, estos datos mostraron que las células CAR-T específicas de CD133 que secretan scFv bloqueador de PD-1 (CD133 CAR-T y PD-1 s) se construyeron con éxito basándose en la transposición mediada por SB a partir de vectores donantes de transposones MC.

Construcción de células CD133 CAR-T y PD-1 s basadas en transposones de la bella durmiente de minicírculos. Un diagrama esquemático de la preparación de células CAR-T y secuencias de células SB100, CD133 CAR-T y CD133 CAR-T y PD-1. B Los minicírculos de las células CD133 CAR, CD133 y PD-1 s CAR y SB100 se evaluaron mediante electroforesis en gel de agarosa. C Análisis representativos de citometría de flujo de la expresión de células CAR-T utilizando una etiqueta c-Myc como se muestra en el sustituto. D La viabilidad celular de células CAR-T de 3 donantes diferentes. Expresión de E CAR detectada en diferentes momentos de 3 donantes sanos diferentes. Un color representa una muestra de paciente. F Detección por transferencia Western del scFv bloqueador de PD-1 secretado en el sobrenadante de células T simuladas, células CD133 CAR-T y células CD133 CAR-T y PD-1 s

A continuación, analizamos la eficacia antitumoral de las células CD133 CAR-T y PD-1 s. Las células CD133 CAR-T y PD-1 s se incubaron primero con un anticuerpo anti-c-Myc-tag biotinilado y luego con microperlas anti-biotina mediante selección positiva. El nivel de expresión de CAR fue superior al 50% después de un enriquecimiento de 7 a 11 veces (Fig. 3A). qPCR y WB confirmaron aún más la integración de CAR (Fig. 3B). La proporción CD4/CD8 fue de aproximadamente 3,5:1, y la mayoría de las células CAR-T eran células CD45RA-CCR7-T (Fig. 3C). El análisis reveló proporciones Treg de 38,4 y 1,23% entre las células CD133 CAR-T y CD133 CAR-T y PD-1 s, respectivamente (archivo adicional 2: Fig. S3), pero las células CD4 + CD133 CAR-T o CD133 CAR- Las células T y PD-1 aún exhibían capacidad antitumoral (archivo adicional 2: Fig. S4). Se eligieron dos líneas celulares hepatocelulares, SK-Hep1 (1% de expresión de CD133) y Hep3B (98,02% de expresión de CD133) (Fig. 3D), para evaluar la actividad citotóxica. La ventaja antitumoral de las células CD133 CAR-T y PD-1 se evaluó mediante ensayos de citotoxicidad continua con proporciones E:T de 1:1, 0,5:1 y 0,25:1 durante 72 h utilizando un analizador celular en tiempo real xCELLigence-Multiple. Sistema de placas (Agilent Technologies). Para las células T totales, en una proporción E:T baja de 0,25:1, las células CAR-T CD133 y CAR-T PD-1 exhibieron una mayor citotoxicidad que las células CAR-T CD133 (P = 0,0309) (archivo adicional 2 : Fig. S4A), mientras que no se observaron diferencias en proporciones E:T de 1:1 y 0,5:1 (P = 0,9650 y P = 0,1837, respectivamente) (archivo adicional 2: Fig. S4A). Estos resultados se correspondieron con los de un estudio previo que muestra que las células CAR-T secretoras de PD-1 scFv exhibieron una mayor citotoxicidad que las células CAR-T convencionales con una relación E:T baja o con un mayor tiempo de exposición al antígeno [20]. Para investigar si las células CD133 CAR-T y PD-1 podrían prevenir el agotamiento de las células CD133 CAR-T, comparamos la citotoxicidad de las células CD133 CAR-T y PD-1 s, las células CD133 CAR-T y las células T simuladas a un baja relación E:T de 0,25:1 mediante citometría de flujo. La citotoxicidad de las células CD133 CAR-T y PD-1 s para la línea celular Hep3B de HCC de alta expresión de CD133 aumentó significativamente en comparación con la de las células CAR-T específicas de CD133 y las células T simuladas en una relación E:T de 0,25:1. durante la noche (P = 0,002 y P <0,0001; Fig. 3E, F). Además, el porcentaje de células T CD107a+ (P = 0,0014; Fig. 3G, H) y la producción de IFNγ (P <0,0001; Fig. 3I) aumentaron en las células CD133 CAR-T y PD-1 s en comparación con Células CAR-T específicas de CD133. En general, las células CD133 CAR-T y PD-1 tienen mejor citotoxicidad que las células CAR-T específicas de CD133 in vitro.

Efectos citotóxicos específicos mejorados de las células CD133 CAR-T y PD-1 contra líneas celulares CD133 + HCC. Se evaluó la expresión de CAR en células Mock, CD133 CAR-T y CD133 CAR-T y PD-1 mediante citometría de flujo después del enriquecimiento con microperlas anti-c-Myc-tag-biotina y anti-biotina. B RT-QPCR y análisis de transferencia Western del número del gen CAR y la expresión de CD3ζ en células Mock T, CD133 CAR-T y CD133 CAR-T y PD-1 s. C El subconjunto CD8 positivo de células CD133 CAR-T y PD-1 y su expresión de CCR7 y CD45R mediante análisis de citometría de flujo. D Análisis por citometría de flujo de la expresión de CD133 en líneas celulares HCC (SK-Hep-1 y Hep3B). E Las imágenes superiores muestran células T simuladas, CD133 CAR-T y CD133 CAR-T y PD-1 s dirigidas a células Hep3B. La flecha roja representa las células CAR-T y la flecha amarilla representa el tumor. La imagen inferior muestra la proporción de células Mock T, CD133 CAR-T o CD133 CAR-T y PD-1 s incubadas con líneas celulares CD133+ HCC (Hep3B) después de 24 h. F Lisis específica (proporción de células 7AAD positivas a células tumorales CD133+ totales) después de 3 días de incubación de células CAR-T con células tumorales. G Imagen representativa de citometría de flujo de la expresión de CD107a en células T simuladas, células CD133 CAR-T y células CD133 CAR-T y PD-1 s incubadas con células tumorales durante 4 h. H La frecuencia de expresión de CD107a en células Mock T, CD133 CAR-T, CD133 CAR-T y PD-1 s solas o incubadas con células Hep3B mediante análisis de citometría de flujo. I La producción de citocinas (IFNγ y TNFα) por células T simuladas, células CD133 CAR-T y células CD133 CAR-T y PD-1 s con o sin incubación de células tumorales durante 4 h se midió mediante ELISA. Media ± DE, n = 4, prueba t de Student no apareada de dos colas, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, ns, no significativo

Exploramos más a fondo el efecto de la secreción de scFv de PD-1 en las células T CD8+ y CD4+ purificadas de la población total de células CAR-T. Para las células T CD8+, las células CAR-T CD133 y CAR-T PD-1 exhibieron mayor citotoxicidad que las células CAR-T CD133 en todas las proporciones E:T (P = 0,0490, P = 0,0003 y P = 0,0007, respectivamente) (archivo adicional 2: Fig. S4B). Para las células T CD4+, las células CAR-T CD133 y CAR-T PD-1 mostraron mayor citotoxicidad que las células CAR-T CD133 en una proporción E:T de 0,25:1 (P = 0,0094) (archivo adicional 2 : Fig. S4C), mientras que no se observaron diferencias en proporciones E:T de 1:1 y 0,5:1 (P = 0,9200 y P = 0,8012, respectivamente) (archivo adicional 2: Fig. S4C).

La expresión de TNFα, IFNγ y CD107a en una relación E:T de 0,25:1 se controló in vitro. La expresión de IFNγ y CD107a en las células T CD8+ y CD4+ de las células CD133 CAR-T y PD-1 s fue mayor que la de las células CD133 CAR-T (P <0,0001, P <0,0001 para las células T CD8+ ; P = 0,009, P <0,0001 para células T CD4+) (archivo adicional 2: Fig. S5A-C). La expresión de TNFα en las células T CD8 + de CD133 CAR-T y PD-1 fue mayor que la de las células CD133 CAR-T (P = 0,0003) (archivo adicional 2: Fig. S5C). Sin embargo, no se encontraron diferencias en la expresión de TNFα entre las células T CD4+ de las células CD133 CAR-T y PD-1 s y las células T CD4+ de las células CD133 CAR-T cuando se incubaron con células Hpe3B (P = 0,1087) (Archivo adicional 2: Fig. S5C).

Para demostrar que las células T espectadoras pueden beneficiarse del scFv bloqueador de PD-1 secretado por las células CD133 CAR-T y PD-1 s cercanas, primero introdujimos PD-1 en células T de donantes sanos utilizando un vector lentiviral seguido de selección de EGFP y puromicina. (Fig. 4A) y obtuvo más del 97% de células T que expresan PD-1 (Fig. 4B). El medio de cultivo de células CD133 CAR-T y PD-1 se concentró y se cultivó conjuntamente con células T normales y células T que expresan PD-1 durante 30 minutos. El análisis de citometría de flujo demostró que el scFv que bloquea PD-1 secretor puede unirse a PD-1 en células T que expresan PD-1 pero no en células T normales (Fig. 4C). Estos resultados confirmaron que el scFv bloqueador de PD-1 secretado por las células CAR-T puede unirse a las células T PD-1+ transeúntes. La inmunofluorescencia también confirmó estos resultados (Fig. 4D). Para demostrar aún más que el scFv bloqueador de PD-1 secretado podría restaurar la función de las células T PD-1+, las células T PD-1+ y Hep3B se incubaron con o sin scFv bloqueador de PD-1. Los niveles de granzima B y TNFα fueron significativamente mayores en presencia de scFv bloqueador de PD-1 en comparación con los de células T PD-1+ y Hep3B en ausencia de scFv bloqueador de PD-1 (P = 0,0006 y P = 0,0094; Fig. 4E-G).

El scFv bloqueador de PD-1 secretado por CD133 CAR-T y PD-1 puede unirse a las células T PD-1 + transeúntes y restaurar la función de las células T. Un diagrama esquemático del lentivirus de sobreexpresión de PD-1 con un indicador de GFP y un marcador de selección de puromicina. B Análisis por citometría de flujo de la expresión de PD-1 y GFP en células T o células T transfectadas con un lentivirus de sobreexpresión de PD-1 y luego seleccionadas con puromicina. C Análisis de citometría de flujo de la unión del scFv que bloquea el PD-1 secretado a células T normales o células T PD-1. D Ensayo de inmunofluorescencia celular de la expresión de scFv bloqueador de PD-1 (GFP) y PD-1 (anti c-Myc-tag-647, rojo) en células T normales, células T PD-1 y células T PD-1 incubadas con el sobrenadante condensado de células CD133 CAR-T y PD-1 s. E Imágenes representativas de citometría de flujo de la expresión de granzima B y TNFα en células T PD-1, células T PD-1 incubadas con Hep3B y células T PD-1 incubadas con Hep3B y scFv bloqueador de PD-1. F, G Cuantificación de la frecuencia de células T granzima B/PD-1 y células T TNFα/PD-1 mediante análisis de citometría de flujo de células T PD-1 +, células T PD-1 + incubadas con células Hep3B y PD-1 + Células T incubadas con células Hep3B y scFv bloqueador de PD-1 secretado por células CD133 CAR-T y PD-1 s. Media ± DE, n = 3, prueba t de Student no apareada de dos colas, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ns, no significativo

Para probar la eficacia in vivo de las células CD133 CAR-T y PD-1, inyectamos células cancerosas Hep3B por vía subcutánea en ratones NCG para establecer tumores de xenoinjerto. Se aplicaron por vía intravenosa células CD133 CAR-T y PD-1 s, células CAR-T específicas de CD133 y células T simuladas el día 0 y el día 7 a una dosis de 5 millones de células T (Fig. 5A). El BLI del grupo tratado con células CD133 CAR-T y PD-1 fue mucho menor que el del grupo tratado con células T simuladas el día 28 (P = 0,0159; Fig. 5B, C). El volumen del tumor medido por BLI del grupo de células CD133 CAR-T y PD-1 fue menor que el de los grupos tratados con células T simuladas y CAR-T específicas de CD133 el día 21 (P = 0,0079 y P = 0,0159 , respectivamente; Fig. 5D). El análisis de supervivencia también reveló que las células CAR-T CD133 y PD1s prolongaron significativamente la supervivencia de los ratones en comparación con las células CAR-T CD133 y las células T simuladas (P = 0,0044 y P = 0,0026, respectivamente; Fig. 5E). Para evaluar la cantidad de células T humanas dentro de los tumores de xenoinjerto de ratón, utilizamos la tinción IHC de tumores de xenoinjerto con un anticuerpo CD3 humano. La tinción de CD3 fue mayor en ratones tratados con células CD133 CAR-T y PD-1 que en ratones tratados con células T simuladas y tratados con CAR-T específico de CD133 (Fig. 5F). Para evaluar la cantidad de células T humanas dentro de los tumores de xenoinjerto de ratón, realizamos tinción IHC de tumores de xenoinjerto con anticuerpo CD3 humano. El área teñida con CD3 en ratones tratados con células CD133 CAR-T y PD-1 s (4/5) fue mayor que la de los ratones tratados con células T simuladas y tratados con CAR-T específico de CD133 (0/5) (0/5) (Fig. 5F, G). Para evaluar la eficacia antitumoral de las células CAR-T CD133 y PD1 en un modelo de ratón con metástasis, se estableció un modelo de ratón con xenoinjerto de metástasis inyectando 2,5 millones de células Hep3B-luc transfectadas en NCG. ratones hasta que BLI mostró un tumor estable y luego se administró terapia con células T 55 días después (Fig. 6A). La curva de crecimiento basada en BLI mostró que el grupo tratado con células CD133 CAR-T y PD-1 exhibió mejores efectos antitumorales que el grupo tratado con células CD133 CAR-T y células T simuladas (P = 0,0260 y P = 0,0087, respectivamente; Figuras 6B, C).

Las células CD133 CAR-T y PD-1 s tienen mejores efectos antitumorales que las células CD133 CAR-T in vivo después de la inyección intravenosa. Un diagrama esquemático del tratamiento con células CAR-T y la detección de tumores. A ratones NCG con tumores de xenoinjerto Hep3B se les inyectaron por vía intravenosa dos dosis de 5 millones de células T simuladas, células CD133 CAR-T o células CD133 CAR-T y PD-1 s una vez que los tumores de xenoinjerto Hep3B alcanzaron 50-150 mm3, como lo revelan las imágenes de bioluminiscencia. . B Los tumores de los grupos tratados con células T simuladas, células CAR-T CD133 y células CAR-T CD133 y PD-1 se controlaron semanalmente mediante imágenes de bioluminiscencia. C Curvas de crecimiento de los grupos tratados con células T simuladas, células CAR-T CD133 y células CAR-T CD133 y PD-1 en la Fig. 5B. D Los volúmenes tumorales de los grupos tratados con células T simuladas, células CD133 CAR-T y células CD133 CAR-T y PD-1 se midieron mediante imágenes de bioluminiscencia. Media ± DE, n = 5, prueba t de Student no apareada de dos colas, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ns, no significativo. E Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de los grupos tratados con células Mock T, CD133 CAR-T y CD133 CAR-T y PD-1 s. **P < 0,01 (prueba de rango logarítmico); ns, no significativo. F Imágenes representativas de la tinción con HE, CD133 y CD3 de los grupos tratados con células Mock T, CD133 CAR-T y CD133 CAR-T y PD-1 s. G Porcentaje de expresión de CD3 en tumores en todos los ratones de la Fig. 5F pertenecientes a los grupos tratados con células Mock T, CD133 CAR-T y CD133 CAR-T y PD-1 s

Las células CD133 CAR-T y PD-1 eliminan las células tumorales en modelos de ratón con tumor de xenoinjerto in situ y metastásico Hep3B. Un diagrama esquemático del tratamiento con células CAR-T. En resumen, a los ratones NCG se les inyectaron por vía intravenosa 2,5 millones de células Hep3B-luc. La metástasis se confirmó mediante imágenes de bioluminiscencia y luego los grupos se trataron con una inyección en el velo de la cola de 5 millones de células Mock T, CD133 CAR-T o CD133 CAR-T y PD-1 s 55 días después de la inoculación. B Imágenes de bioluminiscencia de grupos tratados con células T simuladas, células CAR-T CD133 o células CAR-T CD133 y PD-1 en un modelo metastásico de CHC. C Las curvas de crecimiento de los grupos tratados con células T simuladas, células CD133 CAR-T y células CD133 CAR-T y PD-1 se muestran en la Fig. 6B. Media ± DE, n = 3, prueba t de Student no apareada de dos colas, **P < 0,01, ns, no significativo. D Diagrama esquemático del tratamiento con células CAR-T. En resumen, se inyectaron 2,5 millones de células Hep3B-luc en el hígado de ratones NCG. El tumor se confirmó mediante imágenes de bioluminiscencia y luego se trató con una inyección en el velo de la cola de 5 millones de Mock T, CD133 CAR-T o CD133 CAR-T y PD-1 s 22 días después de la inoculación. E Imágenes de bioluminiscencia de grupos tratados con células T simuladas, células CAR-T CD133 o células CAR-T CD133 y PD-1 en un modelo de tumor de xenoinjerto situ de CHC. Media ± DE, n = 5, prueba t de Student no apareada de dos colas, *P < 0,05, ns, no significativa. F, G El flujo total y el flujo de metástasis de los grupos tratados con células T simuladas, células CAR-T CD133 y células CAR-T CD133 y PD-1 en la Fig. 6E. Media ± DE, n ≥ 2, prueba t de Student no apareada de dos colas, **P < 0,01, ns, no significativo. H El gráfico de barras muestra la frecuencia de células CAR-T 16 días después de la última instancia de terapia celular Mock T, CD133 CAR-T y CD133 CAR-T y PD-1 identificadas mediante citometría de flujo utilizando CD3 antihumano.

Para examinar más a fondo la capacidad antitumoral de las células CD133 CAR-T y PD-1 en un modelo de ratón ortotópico con HCC, inyectamos células Hep3B en el hígado mediante inyección intrahepática directa para establecer un tumor de xenoinjerto in situ que imita el microambiente natural del hígado y el tumor metastásico. HCC. Veintidós días después de la inoculación del tumor, se infundieron por vía intravenosa (iv) cuatro dosis de células CD133 CAR-T y PD-1 s a un total de 5 × 10 ^ 6 células CAR-T. El tumor BLI mostró que la capacidad antitumoral de las células CD133 CAR-T y PD-1 era más fuerte que la de las células Mock T o CD133 CAR-T (P = 0,0317 y P = 0,0556, respectivamente, Fig. 6D –G). Se detectó un mayor porcentaje de células T humanas en el microambiente tumoral del grupo CD133 CAR-T y PD-1 que en el del grupo Mock T (P = 0,0571, Fig. 6H).

Los antígenos específicos de tumores adecuados son esenciales para el diseño y ejecución de la inmunoterapia CAR-T. Una serie de antígenos específicos de tumores, como el Glypican 3 (GPC3), la variante III del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFRvIII), c-Met, PD-L1, CD133, ligandos del miembro D del grupo 2 de NK (NKG2D) (NKG2DL) y algunos Se han explorado y utilizado antígenos cancerosos derivados de virus para construir células CAR-T contra el CHC [21,22,23]. Además, algunas células CAR-T específicas de antígenos tumorales finalmente han entrado en ensayos clínicos; cinco ensayos clínicos investigaron el glipican-3 y también se exploraron otros objetivos menos convencionales, incluidos EpCAM, claudin 18.2, DR5, c-met, EGFRvIII y CD133 (NCT03013712, NCT03302403, NCT03638206, NCT03941626, NCT02541370). Entre estos antígenos tumorales, el CD133 citoplasmático se corresponde con un mal pronóstico en pacientes humanos con CHC [24]. Se sabe que CD133 se expresa en poblaciones de células madre somáticas. Más allá de los sistemas hematopoyético [25] y neural [26], CD133 se expresa fisiológicamente en los epitelios ductales de los órganos glandulares, que se propone albergar células con capacidades de desdiferenciación [27]. Por lo tanto, dirigir CD133+ a células normales del cuerpo podría conllevar el riesgo de posibles efectos secundarios. Sin embargo, la expresión de CD133, que normalmente está presente en las células progenitoras del sistema hematopoyético normal enriquecidas con CD34, es muy baja (<5000 sitios por célula) [28], y se utilizó un modelo de ratón humanizado para probar la toxicidad del anti-CD133. inmunoterapias contra un nicho de células madre hematopoyéticas humanas [29], lo que demostró que la proporción de células CAR-T específicas de CD133 entre la población total de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) CD34 + es mínima. Además, CD133 muestra una tinción limitada en células epiteliales normales en los epitelios ductales [30]. Más importante aún, el CAR-T dirigido por CD133 se evaluó en un estudio clínico de fase 1 y fase 2 (NCT02541370) (23 pacientes, incluidos 14 con CHC), que mostró que la toxicidad primaria debido a una disminución en la proporción de hemoglobina/plaquetas ( Grado 3) mostró autorrecuperación en 1 semana. El evento adverso de alto grado más común fue la hiperbilirrubinemia. Estos resultados proporcionaron evidencia preliminar que muestra que las células CART-133 exhiben una seguridad manejable en el CHC avanzado. En este estudio, demostramos que la expresión total de CD133 se asoció con un mal pronóstico en pacientes masculinos con CHC avanzado, lo que concordaba con los datos de TCGA en línea. Nuestros resultados confirmaron además que CD133 era un objetivo atractivo y razonable para las células CAR-T en el CHC.

Hasta donde sabemos, las células CAR-T CD133 generalmente se construyen utilizando lentivirus o retrovirus, que son largos y costosos [16, 31, 32, 33]. Además, los vectores virales también pueden causar posibles efectos secundarios, incluidos posibles carcinógenos, inmunogenicidad, respuestas inflamatorias y cambios genómicos adversos [34]. El sistema de transposones SB, que comprende dos componentes esenciales, la enzima transposasa y el ADN del transposón, es una herramienta eficaz de transferencia de genes no virales en células de mamíferos [35, 36]. La eficacia de transfección comparable para células generadas por transferencia de genes basada en virus con los beneficios adicionales de menor inmunogenicidad, perfiles de seguridad mejorados, menor complejidad de fabricación y costo de adquisición de vectores que se informaron en estudios anteriores hacen que el sistema de transposones SB sea un sistema atractivo para construir CAR-T. células [37,38,39]. Las células CAR-T dirigidas a CD19 basadas en transposones SB han entrado en estudios clínicos y no han mostrado toxicidad grave [40,41,42], pero en la actualidad, esta tecnología no tiene en cuenta los receptores inhibidores (como PD-1) de las células T. . En este estudio, utilizamos el sistema La Bella Durmiente para construir células CAR-T específicas de scFv CD133 que bloquean PD-1 contra el CHC por primera vez. En combinación, la plataforma MC, que carece de fuentes bacterianas de replicación y genes de resistencia a antibióticos, puede mejorar en gran medida la transposición de SB y la integración de transgenes, lo que da como resultado un mayor número de células diana modificadas de forma estable [39].

El microambiente tumoral es otro desafío que afecta la eficacia de la terapia con células CAR-T. El microambiente tumoral puede inducir receptores inhibidores en las células T, especialmente PD-1 [43]. La combinación de células CAR-T y PD-1 parece más prometedora. Por ejemplo, las células CAR T dirigidas a ICAM1 en combinación con el bloqueo de PD-1 demostraron una capacidad mejorada para erradicar las células tumorales diana que expresan ICAM1 en comparación con el tratamiento con CAR T solo [44]. Se informó sobre un ensayo de fase I de terapia regional con células CAR-T dirigida a mesotelina en combinación con el agente anti-PD-1 pembrolizumab en pacientes con enfermedad pleural maligna, y la mediana de supervivencia general de la terapia combinada fue de 23,9 meses, mientras que solo CAR-T La terapia T fue de 17,7 meses [45]. Sin embargo, la administración sistémica del bloqueo de PD-1 puede causar efectos secundarios llamados eventos adversos relacionados con el sistema inmunológico (IRAE) [46]. Por lo tanto, se han explorado varias estrategias para bloquear el receptor inhibidor PD-1 en las células T, y estas estrategias incluyen la coexpresión de un receptor de conmutación quimérico, con el dominio extracelular de PD-1 vinculado a dominios de señalización de activación, comomodelado de células CAR-T. para expresar un receptor PD-1 negativo dominante [47], la cotransducción de células CAR-T con vectores que expresan shRNA dirigidos a PD-1 [48] y el uso del sistema de edición de genes CRISPR/Cas9 para alterar PD-1 en glipicano- 3 (GPC3) células CAR-T de segunda generación [49]. Sin embargo, el efecto protector se limita a las propias células CAR-T. Los TIL endógenos dentro del microambiente tumoral todavía están sujetos a supresión mediada por PD-1. Por lo tanto, dado que el scFv bloqueador de PD-1 secretado por las células CAR-T pudo unirse a las células espectadoras, planteamos la hipótesis de que la secreción local de células CAR-T específicas de CD133 que secretan células scFv bloqueadoras de PD-1 en este estudio puede proteger células inmunes antitumorales endógenas y reducen el crecimiento de tumores CD133 negativos. Aunque el uso de plásmidos SB de minicírculos para la transfección de células T para construir células CAR-T fue atractivo, solo el 8% de las células CD133 CAR-T y PD-1 s se adquirieron sin enriquecimiento a través de etiquetas c-Myc en nuestro estudio, y esta eficiencia fue similar a la de otros estudios [39, 50]. El procedimiento de enriquecimiento aumenta la duración del cultivo in vitro, lo que añade el riesgo de contaminación en el cultivo in vitro y lleva más tiempo adquirir suficientes células para la aplicación clínica. Además, la duración del tiempo de cultivo in vitro también condujo a una reducción o ausencia de células T de memoria de células madre (Tscm) o células T de memoria central (TCM), que se informó que lograron una respuesta clínica duradera para la terapia con células CAR-T [51] . Por lo tanto, necesitamos mejorar aún más la transfección de células T para construir células CAR-T basadas en el sistema SB. Una estrategia es explorar la amplificación in vivo, como el uso de nanotecnología para realizar la construcción de células CAR-T en la sangre o el uso de vacunas para expandir las células CAR-T in vivo [52,53,54]. En el futuro, mejorar la amplificación y persistencia de las células CAR-T in vivo puede ser una estrategia prometedora para las células CAR-T basadas en transposones SB.

El trabajo presentado aquí respalda la estrategia de utilizar un sistema de modificación genética no viral basado en SB que involucra vectores donantes de transposones MC para simplificar el protocolo actual de producción de células CAR-T, y estas células CAR-T se pueden utilizar para administrar PD-moduladores inmunes. 1 scFv dentro del microambiente tumoral del CHC. Este enfoque podría mejorar potencialmente el resultado clínico en respuesta a la terapia con células CAR-T y mejorar la seguridad de la terapia de bloqueo de puntos de control.

La mayoría de los estudios actuales probaron células CAR-T humanas en animales inmunodeficientes, típicamente ratones NOD Scid Gamma (NSG) trasplantados con tumores humanos. El uso de ratones NSG como receptores de xenoinjertos humanos permite el crecimiento de casi todos los tipos de tumores humanos primarios in vivo, incluida la mayoría de los tumores sólidos y las neoplasias malignas hematológicas que mantienen las características del tumor primario en el paciente. Además, el tratamiento de animales NSG con tumores humanos con células CAR-T se puede utilizar para analizar la eficacia antitumoral de las células CAR-T y la capacidad de estas células para injertarse y persistir en la sangre y los tumores de los animales tratados [55]. . Sin embargo, el uso de estos animales todavía tiene varias limitaciones: (1) estudiar la interacción entre las células CAR-T y el sistema innato humano es difícil, (2) los animales NSG no recrean el microambiente tumoral inmunosupresor en xenoinjertos tumorales, y (3 ) Los ratones NSG no logran reproducir la toxicidad grave observada en algunos ensayos clínicos que prueban las células CAR-T. No obstante, a pesar de estas limitaciones, el modelo NSG ha demostrado ser útil para una evaluación adicional del efecto de destrucción directa de las células CAR-T en los tumores. Otra limitación de este estudio es el tamaño desigual de género en la cohorte. Esta disparidad es consecuencia de la mayor prevalencia de cáncer de hígado en los hombres. En consecuencia, el número de pacientes femeninas disponibles para el análisis se limitó a sólo 6 de 67 pacientes. Dado el número limitado de pacientes mujeres, no pudimos identificar ninguna diferencia inmediata entre pacientes masculinos y femeninos en nuestro análisis. Sin embargo, reconocemos que este desequilibrio de género podría influir potencialmente en los resultados y conclusiones del estudio. Para abordar esta limitación y obtener una comprensión más profunda de la expresión de CD133 y sus implicaciones pronósticas en el cáncer de hígado, es esencial realizar más investigaciones con una cohorte de género más amplia y equilibrada.

En este estudio, encontramos que la expresión de CD133 en pacientes masculinos en la etapa tardía (II y III) se asoció significativamente con peores PFS y OS. Además, los pacientes con CHC avanzado exhiben una mayor expresión de PD-L1 en comparación con los pacientes con CHC en etapa temprana, lo que hace que la proteína CD133 sea un objetivo razonable en la terapia con células CAR-T para pacientes masculinos con CHC avanzado, y estos pacientes también pueden beneficiarse de la PD- 1/Terapia de bloqueo del punto de control PD-L1. Por lo tanto, utilizamos un método no viral para construir con éxito células CAR-T específicas de CD133 que podrían secretar inhibidores del bloqueo del punto de control scFv PD-1 basado en un sistema SB a partir de vectores minicírculo, que exhibe menos inmunogenicidad, tiene un costo menor y es notablemente más seguro en comparación. con vectores virales. Además, confirmamos el efecto del tratamiento con células CD133 CAR-T y PD-1 in vitro e in vivo. En conjunto, nuestros resultados preclínicos indicaron que las células CD133 CAR-T y PD-1 pueden ser una estrategia terapéuticamente tratable para pacientes masculinos con CHC avanzado y alta expresión de CD133.

Los conjuntos de datos utilizados y analizados durante el presente estudio están disponibles a través de solicitud razonable del autor correspondiente.

hormona del crecimiento bovino

Imágenes de bioluminiscencia

T específico del receptor de antígeno quimérico

Células CAR-T específicas de CD133 que secretan scFv bloqueador de PD-1

Puntuación positiva combinada

Células madre cancerosas

Efector al objetivo

Variante III del receptor del factor de crecimiento epidérmico

Glipcano 3

Carcinoma hepatocelular

Células madre y progenitoras hematopoyéticas.

inyección intravenosa

Eventos adversos relacionados con el sistema inmunológico

Repeticiones terminales invertidas

minicírculo

Ligandos del miembro D (NKG2D) del grupo 2 606 de NK

NOD Scid Gamma

Sobrevivencia promedio

Proteína de muerte celular programada 1

Supervivencia libre de progresión

Bella Durmiente

Fragmento variable de cadena única

Células T de memoria central

Células T de memoria de células madre

Elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota

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Agradecemos al personal del Departamento de Bioterapia del Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-Sen por brindar mantenimiento de rutina en el laboratorio.

Este estudio fue apoyado por la Fundación Juvenil de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvenciones n.º 81901764 y 81803079) y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (Subvención n.º 2019M663302).

Chaopin Yang, Jinqi You, Qiuzhong Pan y Yan Tang contribuyeron igualmente a este trabajo.

Departamento de Investigación Experimental, Laboratorio Estatal Clave de Oncología en el Sur de China, Centro de Innovación Colaborativa para la Medicina del Cáncer, Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-Sen, Guangzhou, Guangdong, 510060, República Popular de China

Chaopin Yang, Jinqi You, Qiuzhong Pan, Yan Tang, Yue Huang, Jiamei Gu, Yizhi Wang, Xinyi Yang, Yufei Du, Dijun Ouyang, Hao Chen, Haoran Zhong, Yongqiang Li, Jieying Yang, Yulong Han, Fengze Sun, Yuanyuan Chen , Qijing Wang, Desheng Weng, Tong Xiang y Jianchuan Xia

Departamento de Bioterapia, Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-Sen, Guangzhou, Guangdong, 510060, República Popular China

Chaopin Yang, Jinqi You, Qiuzhong Pan, Yan Tang, Yue Huang, Xinyi Yang, Yufei Du, Dijun Ouyang, Hao Chen, Yongqiang Li, Jieying Yang, Yulong Han, Fengze Sun, Yuanyuan Chen, Qijing Wang, Desheng Weng, Tong Xiang &Jianchuan Xia

Instituto Internacional de Medicina China Traslacional, Universidad de Medicina China de Guangzhou, Guangzhou, Guangdong, 510060, República Popular China

Liming Cai y Zhongqiu Liu

Departamento de Diagnóstico Molecular, Universidad Sun Yat-Sen, Centro Oncológico, Guangzhou, Guangdong, 510060, República Popular China

Jiamei Gu

Departamento de Cirugía Torácica, Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-Sen, Guangzhou, Guangdong, 510060, República Popular China

Yizhi Wang

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JCX, TX, ZQL, QZP y CPY conceptualizaron el estudio. CPY y TX escribieron el artículo. CPY y JQY realizaron la mayoría de los experimentos. CPY, QZP e YH diseñaron los plásmidos utilizados en este estudio. JMG, YQL y QJW participaron en los experimentos de transfección. YT, LMC, HRZ, HC, YZW y XYY ayudaron con los experimentos con animales. JYY, YLH, YT, FZS y YYC ayudaron con algunos experimentos moleculares. YFD, DJOY y JQY ayudaron con los análisis de supervivencia. DSW dio algunas sugerencias en este estudio. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Zhongqiu Liu, Tong Xiang o Jianchuan Xia.

El presente estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación en Humanos (Nº de aprobación GZR2019-287) y el Comité de Ética en Animales Experimentales del Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen (Nº de aprobación 18080B).

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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La secuencia de pSB-EF1alfa-antiCD133 CD8 4-1BB CD3z-P2A-PD-1 que bloquea scFv-WPRE-BGH poliA.

Correlación entre la expresión de CD133 y las características clínicas en el CHC. Tabla S2. Correlaciones entre características clínicas y pronóstico del paciente. Tabla S3. Análisis univariados y multivariados de variables clínicas asociadas con la SSP en pacientes masculinos. Tabla S4. Análisis univariados y multivariados de variables clínicas asociadas con la SG en pacientes masculinos. Figura S1. Análisis de supervivencia utilizando diferentes métodos de evaluación. Figura S2. Viabilidad celular y expresión de CAR después de la transfección con vectores de transposón y transposasa en una proporción de 3:1 en células T de PBMC. Figura S3. Fenotipo Treg (CD4+CD25+Foxp3) de células T CAR CD4 positivas. Figura S4. Efectos citotóxicos específicos de las células CD133 CAR-T y PD-1 contra líneas celulares CD133 + HCC. Figura S5. Efectos citotóxicos específicos mejorados de las células CD133 CAR-T y PD-1 entre las células CAR-T CD8 o CD4 positivas contra líneas celulares CD133+ HCC.

Imágenes de los geles/transferencias originales sin recortar en las Fig. 2 B, F y Fig. 3B.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. La exención de dedicación de dominio público de Creative Commons (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) se aplica a los datos disponibles en este artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito a los datos.

Reimpresiones y permisos

Yang, C., You, J., Pan, Q. et al. La administración dirigida de un scFv que bloquea PD-1 mediante células CAR-T específicas de CD133 mediante la transposición no viral de La Bella Durmiente muestra una eficacia antitumoral mejorada para el carcinoma hepatocelular avanzado. BMC Med 21, 327 (2023). https://doi.org/10.1186/s12916-023-03016-0

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Recibido: 12 de junio de 2022

Aceptado: 31 de julio de 2023

Publicado: 28 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-023-03016-0

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