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Jul 28, 2023

Nrf2 alivia los vuelos espaciales

Communications Biology volumen 6, número de artículo: 875 (2023) Cite este artículo 308 Accesos 4 Detalles de Altmetric Metrics El estrés relacionado con los vuelos espaciales afecta la salud a través de varios sistemas corporales, incluidos

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 875 (2023) Citar este artículo

308 Accesos

4 altmétrico

Detalles de métricas

El estrés relacionado con los vuelos espaciales afecta la salud a través de varios sistemas corporales, incluidos los sistemas hematopoyético e inmunológico, con efectos que van desde alteraciones moderadas de la homeostasis hasta enfermedades graves. El estrés oxidativo parece estar involucrado en estos cambios, y el factor de transcripción Nrf2, que regula la expresión de un conjunto de genes de respuesta al estrés citoprotectores y antioxidantes, ha sido implicado en la respuesta al estrés inducido por los vuelos espaciales. Aquí, mostramos a través de análisis de ratones del proyecto MHU-3, en los que ratones knockout para Nrf2 viajaron en el espacio durante 31 días, que los ratones que carecen de Nrf2 sufren más gravemente de inmunosupresión inducida por los vuelos espaciales que los ratones de tipo salvaje. Descubrimos que un vuelo espacial de un mes desencadenó la expresión de genes marcadores de inflamación tisular en ratones de tipo salvaje, un efecto que fue aún más pronunciado en ausencia de Nrf2. Simultáneamente con la inducción de afecciones inflamatorias, el consumo de factores fibrinolíticos de coagulación y plaquetas aumentó con los vuelos espaciales y se aceleró aún más con la deficiencia de Nrf2. Estos resultados resaltan que Nrf2 mitiga la inflamación inducida por los vuelos espaciales, la inmunosupresión posterior y la microangiopatía trombótica. Estas observaciones revelan una nueva estrategia para aliviar los problemas de salud encontrados durante los vuelos espaciales.

Estudios recientes sobre la biología de los vuelos espaciales han permitido avanzar en la comprensión de que en condiciones ambientales inusuales, como las condiciones extremas de radiación y microgravedad en el espacio, los animales sufren una variedad de alteraciones fisiopatológicas. Para prepararse para la próxima era de viajes espaciales prolongados, resulta crucial una evaluación precisa del impacto de los viajes espaciales en el cuerpo humano. Se estima que la dosis de exposición a la radiación durante una estancia en la Estación Espacial Internacional (ISS) es de 150 mSv/año1, 70 veces mayor que la dosis media en Japón. La irradiación persistente en dosis bajas provoca la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS)2,3,4. Teniendo en cuenta las muchas líneas de evidencia sobre la inflamación celular desencadenada por ROS y la posterior disfunción inmune5, regular el metabolismo de ROS parece ser una de las estrategias más beneficiosas para proteger al cuerpo de lesiones persistentes por radiación durante los viajes espaciales.

La microgravedad provoca alteraciones en la distribución de líquidos en el cuerpo. Si bien los cambios incrementales en la presión arterial están bien controlados cuando el cuerpo está en posición vertical bajo gravedad normal, este gradiente se vuelve uniforme en todo el cuerpo en el espacio, lo que supone una carga para el sistema cardiovascular central6,7. Esto da lugar a un desplazamiento de líquido, provoca una elevación significativa de la presión microvascular en el compartimento central y la cabeza, y provoca síntomas en el sistema nervioso central a través de hipertensión intracraneal8. En particular, estudios previos revelaron que el volumen total de plasma circulante se reduce durante los vuelos espaciales, lo que resulta en aumentos en los parámetros de los glóbulos rojos (RBC) como resultado de la hemoconcentración9, mientras que la destrucción de los glóbulos rojos se acelera por el estrés de los vuelos espaciales10. El estado policitemico se revierte gradualmente mediante la adaptación hematopoyética a la microgravedad durante una estancia en el espacio11. Por el contrario, como resultado de la redistribución de líquidos durante la adaptación a la gravedad terrestre, los astronautas que regresan del espacio desarrollan una auténtica anemia12.

Se ha demostrado que, además de la radiación cósmica, las alteraciones de la gravedad también generan ROS en las células13, lo que puede conducir al inicio y progresión de la inflamación5. En conjunto, estas observaciones de estudios de biología espacial respaldan la idea de que el estrés mecánico inducido por la microgravedad y el estrés oxidativo inducido por la radiación convergen para afectar al cuerpo, y el impacto combinado de estos dos estreses puede provocar secuelas después de la misión espacial, como una mayor tasa de incidencia de enfermedades cardiovasculares14, enfermedades neurooculares15 y/o hemólisis persistente10.

El factor de transcripción Nrf2 (factor-2 relacionado con NF-E2) es un regulador maestro de las vías de defensa que responden a diversas tensiones, incluidas las oxidativas, mecánicas y químicas tóxicas (a menudo electrófilas)16. Tras un aumento en los niveles celulares de ROS, Keap1 (proteína 1 asociada a ECH similar a Kelch) detecta el aumento en los niveles de ROS y detiene la ubiquitinación de Nrf2; por lo tanto, Nrf2 escapa a la proteólisis proteasomal y se acumula rápidamente en el núcleo. Nrf2 regula positivamente un conjunto de genes citoprotectores que codifican enzimas de desintoxicación y enzimas antioxidantes que eliminan ROS16.

Nuestra hipótesis es que Nrf2 puede proteger contra tensiones relacionadas con el espacio. Para abordar esta hipótesis, diseñamos y llevamos a cabo el proyecto Mouse Habitat Unit-3 [MHU-3], en el que seis ratones Nrf2-knockout (KO)17 y seis ratones de tipo salvaje (WT) viajaron a la ISS y permanecieron allí durante 31 días18. Los análisis iniciales de los ratones demostraron que los vuelos espaciales aumentaron significativamente la expresión de los genes diana Nrf2. Los análisis revelaron además que Nrf2 afecta de manera diferencial las vías de señalización activadas por los vuelos espaciales18. Por ejemplo, encontramos que Nrf2 preserva la homeostasis del músculo esquelético, el tejido renal y el tejido adiposo blanco del epidídimo19,20,21.

En este sentido, si bien se ha demostrado que los viajes espaciales influyen en los índices de glóbulos rojos y en el sistema inmunológico10,12,22, los detalles de los mecanismos subyacentes aún están por aclararse. Además, no se ha abordado la relación entre los cambios hematopoyéticos e inmunológicos y la función de Nrf2. Por lo tanto, en este estudio nuestro objetivo era ampliar los análisis de los ratones de la misión MHU-3, con especial atención a las evaluaciones hematológicas e inmunológicas, junto con una serie de desafíos experimentales para superar las dificultades inherentes al estudio espacial. Curiosamente, la hemoconcentración causada por la microgravedad en los astronautas no se observó en ratones cuadrúpedos durante los vuelos espaciales, mientras que un aumento en la masa de glóbulos rojos y la represión de la expresión del gen eritroide fueron evidentes después de regresar a la Tierra, independientemente de la expresión de Nrf2. Los vuelos espaciales cambiaron notablemente la fisiología de las plaquetas, lo que concomitantemente con un aumento en el estado de recambio de las plaquetas. En marcado contraste, la expresión de genes relacionados con el sistema inmunológico fue reprimida por los vuelos espaciales de una manera dependiente de Nrf2. Este estudio demuestra inequívocamente que Nrf2 alivia la inflamación mediada por los vuelos espaciales y la posterior represión inmune y la microangiopatía trombótica.

En la misión MHU-3, enviamos al espacio 6 ratones macho de tipo salvaje y 6 ratones macho Nrf2-KO (ratones FL-WT y FL-KO, respectivamente) (Fig. 1a) 18. Estos ratones permanecieron en la ISS durante 31 días. Como control terrestre, utilizamos la misma cantidad de ratones machos de tipo salvaje y Nrf2-KO (ratones GC-WT y GC-KO, respectivamente). El experimento de control en tierra se llevó a cabo con la máxima precisión para simular las condiciones del experimento de vuelo, que se logró empleando tecnología idéntica de alojamiento en jaula única, suministro de alimentos y agua de laboratorio, así como el mismo sistema para monitorear el consumo de alimentos y la ingesta de agua de los ratones18. 21. Se recogieron muestras de sangre de la cola de los ratones FL en tubos capilares 17 días antes del lanzamiento (L-17), 18 días después del lanzamiento mientras estaban en el espacio (L + 18) y 2 días después del aterrizaje (R + 2). También se recogieron muestras de sangre de la cola de ratones GC en los días correspondientes. No se pudieron recolectar muestras de sangre de un ratón FL-WT en L + 18 debido a una lesión menor en la cola y a la decisión del veterinario21. Después de recoger la sangre, los tubos capilares se centrifugaron inmediatamente en la ISS. Tomamos fotografías de los tubos de centrífuga (Fig. 1b) para medir la longitud de la sangre total y de los glóbulos rojos concentrados (RBC), como lo muestran las líneas roja y azul, respectivamente (Fig. 1b, Fig. 1 complementaria). Nos referimos al porcentaje de longitud de los glóbulos rojos empaquetados (línea roja versus línea azul) como el valor del hematocrito de la cola (t-Hct) (Fig. 1b).

a Descripción general del proyecto MHU-3, en el que se recogieron muestras de sangre de la vena de la cola de ratones. b Imágenes representativas de los tubos de centrífuga utilizados para medir los valores de HCT de cola (t-Hct). Las líneas rojas y azules indican la longitud de los concentrados de glóbulos rojos y de la sangre completa, respectivamente. c Gráficos de puntos de t-Hct en L-17 (izquierda) y R + 2 (derecha). *p < 0,05. d Gráficos de puntos de t-Hct en L + 18. e Curso temporal de los cambios en t-Hct en L-17, L + 18 y R + 2. Los datos de 6 ratones GC-WT y 6 GC-KO se muestran en el panel izquierdo, y los de 3 ratones FL-WT y 1 FL-KO se muestran en el panel derecho. Se muestra el valor P obtenido con la prueba de rangos con signo de Wilcoxon de dos colas para la comparación entre los valores obtenidos en L + 18 y R + 2 en ratones FL. Los puntos representan animales individuales en (c), (d) y (e). Las medias se muestran en los gráficos de (d) y (e).

Es de destacar que el t-Hct de los ratones FL en R + 2 aumentó significativamente en comparación con el de los ratones GC en R + 2 (Fig. 1c). Este cambio también se observó en ratones Nrf2-KO, pero el t-Hct antes del lanzamiento (L-17) no cambió sustancialmente en los cuatro grupos de ratones (Fig. 1c). Como obtuvimos sangre de la cola del mismo grupo de ratones durante su estadía en la ISS (L + 18), intentamos examinar el HCT en L + 18. Lamentablemente, sin embargo, no se pudo determinar el t-Hct de siete ratones FL. ya que los bordes de la sangre total quedaron ocultos inadvertidamente por etiquetas (Figura complementaria 1). No obstante, pudimos medir el t-Hct de tres ratones FL-WT y uno FL-KO. Como se muestra en la Fig. 1d, el t-Hct de estos ratones en L + 18 fue comparable al de los ratones GC-WT y GC-KO. Las alteraciones en el tiempo de los cuatro ratones FL demostraron una tendencia al aumento de t-Hct después del aterrizaje, pero no hubo cambios sustanciales en t-Hct entre L-17 y L + 18 (Fig. 1e). Estos hallazgos demuestran que la transición de la gravedad normal a la microgravedad y la exposición continua a la microgravedad no alteran el t-Hct, pero la transición de la microgravedad a la gravedad normal da lugar a un aumento del t-Hct.

Para verificar los cambios en los índices hematopoyéticos de los ratones después del vuelo espacial, recolectamos sangre de la vena cava inferior (VCI) de ratones anestesiados utilizando jeringas recubiertas de EDTA inmediatamente antes de la eutanasia después del regreso a la Tierra en R + 2. Las muestras de sangre se conservaron en hielo, y los índices hematopoyéticos de los ratones FL se midieron con un hemocitómetro en un laboratorio ubicado en la costa oeste de EE. UU. dentro de las 6,5 h posteriores a la extracción de sangre, mientras que los de los ratones GC se midieron en Japón.

Los índices hematopoyéticos se muestran en la Fig. 2a. De acuerdo con los resultados de t-Hct, los valores de hematocrito (Hct) de las muestras de IVC se elevaron significativamente al mismo tiempo que el recuento de glóbulos rojos en los grupos de ratones FL, independientemente del genotipo (Fig. 2b). Es importante destacar que los valores del ancho de distribución de los glóbulos rojos (RDW), que es un índice de la heterogeneidad del tamaño de los glóbulos rojos, se elevaron significativamente en ratones FL-WT y FL-KO, acompañados de una disminución en el volumen corpuscular medio (MCV) (Fig. .2b). Estos resultados sugieren que los glóbulos rojos de los ratones FL exhiben características de microcitosis y anisocitosis. Se sabe que el aumento del ADE es un marcador pronóstico de diversas enfermedades, como enfermedades oncológicas23, enfermedades renales crónicas24, enfermedades cardiovasculares25 e infecciones graves26,27. Por el contrario, no observamos cambios sustanciales en el recuento de glóbulos blancos (WBC) (Fig. 2c). Por tanto, estos resultados demuestran que los vuelos espaciales provocan anomalías en el tamaño y el número de glóbulos rojos en ratones.

a Resumen de índices hematopoyéticos. Se muestran los valores medios y las desviaciones estándar. b – d Gráficos de puntos de los valores indicados para los parámetros eritroides (b), recuentos de glóbulos blancos (c) y parámetros de plaquetas (d). Los puntos representan animales individuales. Las medias se muestran en los gráficos. *p < 0,05.

Desafortunadamente, el hemocitómetro del laboratorio de EE. UU. no pudo evaluar adecuadamente la concentración de hemoglobina debido a problemas desconocidos. Por lo tanto, no pudimos determinar los otros dos índices de Wintrobe.

A continuación examinamos los índices de plaquetas. La cantidad de plaquetas no cambió sustancialmente en respuesta al vuelo espacial o a la eliminación del gen Nrf2 (Fig. 2d, panel izquierdo). Esta observación contrasta con la observación anterior, en la que el recuento de plaquetas aumentó después del aterrizaje28. La razón de esta diferencia no está clara en la actualidad, pero suponemos que los siguientes puntos pueden ser pertinentes. Si bien ambos estudios se realizaron utilizando la línea de ratones C57BL/6, el último estudio llevó a cabo 12 días de vuelo espacial utilizando ratones hembra28, mientras que nuestro estudio llevó a cabo 31 días de vuelo espacial utilizando ratones macho.

También encontramos que el valor plaquetario (PCT), que representa el volumen ocupado por las plaquetas en la sangre, se elevó notoriamente durante los vuelos espaciales y, en consecuencia, el volumen medio de plaquetas (MPV) se elevó significativamente en ratones FL, independientemente de la presencia o ausencia. de Nrf2 (Fig. 2d). Además, el ancho de distribución de plaquetas (PDW), un índice de la heterogeneidad del tamaño de las plaquetas, se elevó en las muestras de FL de ratones WT y Nrf2-KO en comparación con las muestras de GC correspondientes (Fig. 2d).

A lo largo de este estudio, aplicamos la prueba de Kruskal-Wallis para evaluar las diferencias entre los grupos GC-WT, FL-WT, GC-KO y FL-KO, y posteriormente empleamos comparaciones múltiples de Steel-Dwass para evaluar las diferencias de múltiples pares de grupos. Dado el considerable impacto de los vuelos espaciales en los parámetros probados, nuestro objetivo fue integrar las evaluaciones de los efectos del estado de Nrf2 mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon, comparando GC-WT con GC-KO y FL-WT con FL-KO, individualmente.

Para evaluar el impacto de los estados de Nrf2 en los parámetros plaquetarios tanto en condiciones terrestres como de vuelos espaciales, contrastamos los valores de los parámetros plaquetarios entre ratones WT y Nrf2-KO en condiciones de GC y FL de forma independiente (Figura complementaria 3). Nuestro análisis alternativo produjo resultados consistentes, lo que indica que las alteraciones en los valores de MPV y PVD fueron amplificadas específicamente por el estado de Nrf2-KO en condiciones de vuelos espaciales. En conjunto, estos resultados confirman que los vuelos espaciales tienen un impacto significativo en la homeostasis de los eritrocitos y las plaquetas.

Las elevaciones significativas en MPV y PDW sugirieron la presencia de un aumento del recambio plaquetario en ratones FL29. En este sentido, cabe señalar que los vuelos espaciales modifican el metabolismo de los lípidos en ratones, con niveles elevados de glicerofosfolípidos y esfingolípidos en el plasma durante los vuelos espaciales21. Se ha sugerido que las concentraciones elevadas de lípidos en plasma se correlacionan con el riesgo de trombosis venosa30. Además, encontramos en la base de datos integrada Biobank for Space Life Science (ibSLS) (https://ibsls.megabank.tohoku.ac.jp/)31 que el N-óxido de trimetilamina (TMAO), un metabolito derivado de los alimentos que contiene fosfatidilcolina, aumenta en el plasma durante los vuelos espaciales (Figura complementaria 2). La OTMA se asocia con un riesgo de eventos trombóticos en humanos mediante la inducción de lesión inflamatoria endotelial y activación plaquetaria32,33. Teniendo en cuenta estas amplias observaciones, planteamos la hipótesis de que el estrés de los vuelos espaciales puede activar la trombosis.

Para abordar esta hipótesis, primero examinamos la expresión del gen vWF que codifica el factor von Willebrand (vWF) en tejidos no hematopoyéticos, es decir, el timo, el tejido adiposo pardo interescapular (iBAT) y las áreas del hueso temporal (Tp), incluido el oído interno. tejido, eWAT, hígado y cerebro de ratones en la base de datos ibSLS. El vWF se produce principalmente en células endoteliales y megacariocitos, y el vWF plasmático aumenta simultáneamente con la inflamación y participa en la patogénesis de enfermedades intravasculares34. Descubrimos que el nivel de expresión de vWF tendía a aumentar en algunos tejidos de ratón WT-FL en comparación con los tejidos WT-GC (Fig. 3a). En particular, la expresión del gen vWF se elevó significativamente en el timo y el iBAT de ratones FL-KO en comparación con los ratones GC-KO (Fig. 3b). Este resultado fue consistente en un análisis estadístico alternativo que comparó directamente el efecto de Nrf2-KO en condiciones de GC y FL (Figura complementaria 4).

a Mapa de calor de la expresión relativa del gen vWF en el timo, tejido adiposo marrón interescapular (iBAT), hueso temporal (TpB), tejido adiposo blanco epididimal (eWAT), hígado y cerebro de GC-WT, FL-WT, GC -Ratones KO y FL-KO. El valor medio obtenido para cada gen en ratones GC-WT se fijó en uno. b Gráfico de puntos de la expresión del gen vWF en el timo, iBAT y TpB. c Mapa de calor de la expresión relativa de genes del factor de coagulación en los hígados de ratones GC-WT, FL-WT, GC-KO y FL-KO. El valor medio obtenido para cada gen en ratones GC-WT se fijó en uno. d Gráfico de puntos de la expresión de genes de fibrinógeno en el hígado. e Gráfico de puntos de la expresión de los genes Kng1, Kng2, Klkb1 y F12 en el hígado. f Gráfico de puntos de la expresión de los genes Proc, Serpina5 y Pros en el hígado. g Gráfico de puntos de la expresión de los genes Plg y Serpinf2 en el hígado. Los puntos representan animales individuales. Las medias se muestran en los gráficos. *p < 0,05.

Luego examinamos la expresión de genes que codifican el factor tisular (factor de coagulación III; F3), la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM1) y la molécula de adhesión de células vasculares 1 (VCAM1), todos los cuales están involucrados en la activación endotelial35,36. De manera similar a los resultados obtenidos para el gen vWF, la expresión de Icam1 y Vcam1 tendía a ser elevada en el timo e iBAT de ratones FL-KO en comparación con los ratones GC-KO, y esta tendencia también fue clara en los ratones Nrf2-KO (suplementario). Figura 5).

Dado que el hígado desempeña un papel fundamental en el proceso de coagulación al sintetizar factores de coagulación, anticoagulantes y proteínas de fibrinólisis, a continuación analizamos la expresión de los factores de coagulación en el hígado utilizando la base de datos ibSLS. Se encontró que la expresión de una variedad de factores de coagulación estaba elevada tanto en ratones FL-WT como FL-KO, y las elevaciones fueron marcadamente prominentes en los ratones FL-KO (Fig. 3c).

Tras examinar genes individuales, encontramos que los niveles de genes de fibrinógeno (α, β y γ) aumentaron con el vuelo espacial y la elevación de estos genes se volvió especialmente prominente en respuesta a la combinación de vuelo espacial y Nrf2-KO (Fig. 3d ). Este resultado pareció ser reproducible en el análisis estadístico alternativo (Figura 6a complementaria), lo que indica que la activación del gen del fibrinógeno inducida por los vuelos espaciales en realidad mejoró en el fondo Nrf2-KO. También se observó una expresión elevada de los genes Kng1/Kng2, Klkb1 y F12, que codifican cininógenos moleculares, precalicreína y factor de coagulación XII, respectivamente, en los ratones FL en comparación con los ratones GC y fue especialmente prominente en el fondo Nrf2-KO (Fig. .3e). Es importante destacar que el análisis estadístico alternativo reveló que los cambios en la expresión del gen F12 se intensificaron específicamente por el estado de Nrf2-KO en condiciones de vuelo espacial (Figura complementaria 6b). Estos hallazgos nos llevaron a plantear la hipótesis de que el recambio de los factores de coagulación, especialmente los factores implicados en la fase temprana de la cascada de coagulación intrínseca, aumenta notablemente en los ratones FL y el aumento se magnifica en la condición Nrf2-KO. Además, la expresión del gen Proc que codifica la proteína C se elevó significativamente en los hígados de ratones FL, mientras que la expresión del gen Serpina5 que codifica un inhibidor de la proteína C se reguló negativamente en los ratones FL en comparación con los ratones GC, y la expresión de la proteína ProS que codifica S no cambió entre los cuatro grupos (Fig. 3f).

Curiosamente, la expresión del gen Plg (plasminógeno) se activó durante los vuelos espaciales, y esta activación se incrementó en el fondo Nrf2-KO. La expresión de Serpinf2 que codifica α2-antiplamina también pareció aumentar con la combinación de vuelos espaciales y Nrf2-KO (Fig. 3g, Fig. complementaria 6c). En conjunto, estos datos muestran que los vuelos espaciales inducen perturbaciones en la expresión génica de la vía fibrinogenolítica de congelación, y estas perturbaciones ocurren en bloque, lo que lleva a la activación de la trombosis y la susceptibilidad fibrinolítica en ratones FL, que parece empeorar en ausencia de actividad de Nrf2.

A medida que los vuelos espaciales aumentaron el número de glóbulos rojos y los valores de Hct, a continuación examinamos la masa del bazo en ratones FL. Inesperadamente, el peso del bazo disminuyó con los vuelos espaciales, y la disminución fue significativa entre los ratones FL-KO y los ratones GC-KO (Fig. 4a). De acuerdo con esta observación, también se observó una disminución en la proporción entre el peso del bazo y el peso corporal total después del vuelo espacial37.

un diagrama de puntos del peso del bazo. Tenga en cuenta que una reducción en el tamaño del bazo se hace evidente en los ratones FL-KO. b Imágenes representativas que muestran la tinción con HE de secciones transversales esplénicas incluidas en parafina de ratones con los genotipos indicados. c Vistas ampliadas de las regiones seleccionadas (cuadros blancos) de las imágenes en (b). Tenga en cuenta que la contracción de la pulpa blanca (WP) es evidente en ratones FL-WT y FL-KO. d Frecuencia de celdas WP en secciones transversales. e Número calculado de células que residen en las áreas de WP (izquierda) y pulpa roja (RP, derecha) en bazos individuales. El valor medio obtenido para los ratones GC-WT en cada grupo se fijó en 100%. Los puntos representan animales individuales. Las medias se muestran en los gráficos. *p < 0,05.

Para abordar el motivo de la disminución del peso del bazo, examinamos secciones transversales del bazo mediante tinción con hematoxilina-eosina (HE). Notamos una marcada disminución en las áreas de pulpa blanca (WP) en comparación con las áreas de pulpa roja (RP) en los bazos de ratones FL (Fig. 4b, c). La cuantificación del número de células WP y RP en las secciones transversales se realizó utilizando el software QuPath38. Los resultados demostraron que el porcentaje de células WP disminuyó significativamente en los bazos de los ratones FL-WT y FL-KO en comparación con los de los respectivos ratones GC (Fig. 4d, Fig. 7 complementaria). Luego calculamos el número de células WP y RP que residen en bazos individuales multiplicando los porcentajes de células WP y RP obtenidas de las secciones transversales por el peso del bazo (Fig. 4e). Establecimos el número de células WP y RP en los bazos de ratones GC-WT en 100. Los resultados indican que el número de células WP en el bazo disminuyó significativamente en los ratones FL, mientras que el número de células RP permaneció sin cambios o aumentó. Por tanto, la disminución del peso del bazo parece deberse a la reducción de las células WP. Dado que las células WP están compuestas en gran parte por células inmunitarias, incluidos linfocitos y macrófagos, estos resultados respaldan nuestra afirmación de que los vuelos espaciales reducen la abundancia de células inmunitarias esplénicas, lo que conduce a una mayor citoprotección en el espacio.

Realizamos un análisis de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) de genes esplénicos utilizando expresión diferencial integrada y análisis de vías (iDEP.95) 39 en base a los datos de RNA-seq obtenidos en nuestro informe anterior 18. Descubrimos que la expresión de 13 genes era menor en FL-WT en comparación con GC-WT. Curiosamente, el número de genes afectados por la disminución debida a los vuelos espaciales aumentó a 41 en el fondo Nrf2-KO (Fig. 5a). La mayoría de los genes regulados negativamente por los vuelos espaciales en ratones WT se superpusieron con los regulados negativamente en el fondo Nrf2-KO (12 de 13; Fig. 5a), lo que sugiere que la regulación negativa de los genes esplénicos durante los vuelos espaciales se extendió si se anulaba la función de Nrf2. En particular, de acuerdo con un estudio previo37, los tres principales términos de ontología genética (GO) asociados con DEG regulados negativamente en FL-WT frente a GC-WT y FL-KO frente a GC-KO estuvieron todos involucrados en la "función de los eritrocitos" (Fig. 5b).

un diagrama de Venn de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) regulados negativamente en el bazo para las comparaciones FL-WT versus GC-WT (verde) y FL-KO versus GC-KO (naranja). b Análisis de ontología genética (GO) de DEG regulados negativamente para las comparaciones FL-WT versus GC-WT (filas superiores) y FL-KO versus GC-KO (filas inferiores). Los términos GO relacionados con la eritropoyesis están marcados con un fondo rosa. Se muestran el número de genes y los valores de p ajustados. c Mapa de calor de la expresión relativa de genes regulados negativamente en la comparación FL-WT frente a GC-WT o FL-KO frente a GC-KO. El valor medio obtenido para cada gen en ratones GC-WT se fijó en uno. Los genes relacionados con los eritroides están coloreados en rojo. Se muestran los valores de P ajustados para las comparaciones FL-WT versus GC-WT y FL-KO versus GC-KO. d Gráfico de puntos de la expresión de genes representativos relacionados con eritroides. Los puntos representan animales individuales. Las medias se muestran en los gráficos. *p < 0,05.

Como se muestra en el mapa de calor de los 42 genes regulados negativamente, los niveles de expresión de los genes variaron entre ratones GC-WT y GC-KO individuales (Fig. 5c). En el mapa de calor, el valor medio de la expresión genética de seis ratones GC-WT se establece en 1 y los genes de eritrocitos se muestran en rojo. Si bien la expresión de estos 42 genes mostró una tendencia creciente en los ratones GC-KO en comparación con los ratones GC-WT, su expresión disminuyó sustancialmente tanto en los ratones FL-WT como en los FL-KO. Confirmamos que la expresión de los genes Alas2, Slc41a, Hba-a2 y Rhag disminuyó sustancialmente después del vuelo espacial, independientemente de la expresión de Nrf2 (Fig. 5d). Por tanto, estos resultados demuestran que el estrés relacionado con el espacio tiene un fuerte impacto negativo en la expresión de genes relacionados con eritroides en el bazo, lo que supera la contribución de Nrf2 a la regulación genética.

Para examinar los cambios en las poblaciones de células hematopoyéticas inducidos por los vuelos espaciales, realizamos análisis de citometría de flujo. Si bien se prefieren las muestras frescas para el análisis de citometría de flujo, las limitaciones experimentales en el estudio con ratones espaciales no nos permitieron realizar muestreos en el mismo lugar para ratones FL y GC. Por lo tanto, para abordar este problema, decidimos utilizar muestras criopreservadas que se descongelaron al mismo tiempo (Fig. 6a).

a Diagrama esquemático de análisis de citometría de flujo de células mononucleares del bazo. LN2, nitrógeno líquido. b Gráfico de puntos de las frecuencias de ckit+CD71+Ter119- eritroblastos y megacariocitos CD61+CD41+ en células vivas del bazo. c Gráfico de puntos de las frecuencias de macrófagos M1 y M2, células dendríticas mieloides (mDC) y DC plasmocitoides (pDC) en células vivas del bazo. d Gráfico de puntos de las frecuencias de prognidores T, progenitores B, células B, células asesinas naturales (NK), neutrófilos, eosinófilos, basófilos y mastocitos en células vivas del bazo. Los puntos representan animales individuales. Las medias se muestran en los gráficos. *p < 0,05.

Primero medimos la viabilidad de las células totales y de linaje negativo recuperadas de crioviales de células del bazo y de la médula ósea. Descubrimos que la viabilidad de las células frescas del bazo y de la médula ósea era de aproximadamente el 60% y el 90%, respectivamente, y la viabilidad de las células criopreservadas variaba entre las muestras. Las células criopreservadas mostraron una viabilidad del 50 al 90% en comparación con la de las células frescas, con poca diferencia entre las células criopreservadas del bazo y de la médula ósea (Figuras complementarias 8a, b).

Una observación sorprendente fue que cuando analizamos la frecuencia de células comprometidas con el linaje mediante la expresión de marcadores de superficie, las células positivas para Ter119, un marcador para células eritroides desde las etapas tempranas de proeritroblastos hasta eritrocitos maduros, mostraron una supervivencia muy pobre. La cantidad de células Ter119 positivas se redujo a aproximadamente el 0% en todos los ratones (Figura complementaria 8c). Por lo tanto, excluimos del experimento las células positivas para Ter119. No obstante, encontramos que los progenitores eritroides cKit + CD71 + Ter119 y los megacariocitos CD41 + CD61 + eran viables (Figura complementaria 8d, e) y podían analizarse. La abundancia de progenitores eritroides cKit + CD71 + Ter119- se redujo significativamente tanto en ratones FL-WT como FL-KO (Fig. 6b). Por el contrario, la abundancia de megacariocitos CD41+CD61+ aumentó en ratones FL-WT y FL-KO, lo que indica que la bifurcación eritroide-megacariocítica está inclinada hacia el linaje megacariocítico en los bazos de ratones en el espacio.

Con respecto a las poblaciones de células relacionadas con el sistema inmunológico, encontramos cambios significativos en las frecuencias de dos poblaciones de células en el bazo. Una era la fracción de macrófagos M1 (Fig. 6c) y la otra eran células dendríticas plasmocitoides (pDC) (Fig. 6c). Ambas poblaciones de células mostraron una abundancia notablemente disminuida después del vuelo espacial. Por el contrario, no encontramos diferencias sustanciales en las frecuencias de los macrófagos M2 o las CD mieloides (mDC) (Fig. 6c, dos paneles del medio). De manera similar, no encontramos cambios significativos en las frecuencias de células linfoides, granulocitos o mastocitos en el bazo entre los grupos GC y FL, a excepción de dos poblaciones de células (Fig. 6d). Uno de esos cambios fue un aumento en la abundancia de neutrófilos en ratones FL-WT en comparación con ratones GC-WT, y el otro fue un aumento en la abundancia de eosinófilos en ratones FL-KO en comparación con ratones GC-KO (Fig. 6d). Por lo tanto, estos resultados demuestran que los vuelos espaciales alteran la distribución de las poblaciones de células hematopoyéticas en el bazo dentro de la fracción controlada por células negativas para Ter119.

Luego examinamos las frecuencias de células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSPC) en el bazo, incluidas las células de linaje negativo/Sca1 positivo/cKit positivo (LSK), células de linaje negativo/Sca1 negativo/cKit positivo (LK) , progenitores mieloides comunes (CMP), progenitores de granulocitos y macrófagos (GMP), progenitores de megacariocitos/eritrocitos (MEP), células madre hematopoyéticas a largo plazo (LT-HSC), HSC a corto plazo (ST-HSC), progenitores multipotentes subconjunto 2 (MPP2), progenitores multipotentes subconjunto 3 (MPP3) y progenitores multipotentes preparados con linfoides (LMPP). Estas poblaciones progenitoras no cambiaron sustancialmente durante los vuelos espaciales, excepto las LMPP, cuya abundancia disminuyó moderadamente en los ratones FL-WT en comparación con los ratones GC-WT (Figura complementaria 9a).

Luego realizamos análisis de citometría de flujo similares para muestras de médula ósea congeladas (Fig. 7a). Como se muestra en la sección anterior, la viabilidad de las células de la médula ósea superó a la de las células del bazo (Figura complementaria 8a). Como se observó para las muestras de bazo, las frecuencias de HSPC en la médula ósea no cambiaron sustancialmente entre los cuatro grupos de ratones (Figura complementaria 9b), lo que indica que los vuelos espaciales no influyen en la distribución de HSPC.

a Diagrama esquemático de análisis de citometría de flujo de células mononucleares de médula ósea. b Gráfico de puntos de las frecuencias de ckit+CD71+Ter119- eritroblastos y megacariocitos CD61+CD41+ en células vivas de la médula ósea. c Gráfico de puntos de las frecuencias de macrófagos, mDC y pDC M1 y M2 en células vivas de la médula ósea. d Gráfico de puntos de las frecuencias de progenitores T, progenitores B, células B, células NK, neutrófilos, eosinófilos, basófilos y mastocitos en células vivas de la médula ósea. Los puntos representan animales individuales. Las medias se muestran en los gráficos. *p < 0,05.

Luego analizamos las células comprometidas con el linaje en la médula ósea y comparamos los resultados con los obtenidos para el bazo. Sorprendentemente, encontramos que las frecuencias de los progenitores eritroides cKit + CD71 + Ter119 en la médula ósea aumentaron en ratones FL-WT y FL-KO, mientras que las de los megacariocitos CD41 + CD61 + no cambiaron sustancialmente (Fig. 7b). Estos cambios fueron completamente diferentes a los observados en el bazo (Fig. 6b).

De manera similar, la distribución de las células relacionadas con el sistema inmunológico cambió en la médula ósea después del vuelo espacial, pero las direcciones de los cambios fueron bastante diferentes de las observadas en el bazo. Las frecuencias de los macrófagos M1 no cambiaron mucho después del vuelo espacial. Por el contrario, la deficiencia de Nrf2 aumentó fuertemente la frecuencia de macrófagos M1 (Fig. 7c). Las frecuencias de mDC aumentaron en ratones FL-WT en comparación con ratones GC-WT, mientras que las frecuencias de pDC en ratones FL-WT no cambiaron mucho en comparación con las de ratones GC-WT (Fig. 7c).

También encontramos una reducción significativa en la abundancia de progenitores B y un aumento en la abundancia de células NK en ratones FL-WT y FL-KO en comparación con los ratones GC-WT y GC-KO, respectivamente, mientras que las frecuencias de progenitores T, B maduros Las células, los granulocitos y los mastocitos no cambiaron mucho (Fig. 7d). Dado que la interacción entre las células NK y los linfocitos B juega un papel importante en el sistema inmunológico40, estos cambios pueden contribuir, al menos en parte, al deterioro del sistema inmunológico durante los vuelos espaciales. Por tanto, estos resultados demuestran que los vuelos espaciales alteran la homeostasis hematopoyética al afectar la distribución de las poblaciones celulares, especialmente las poblaciones celulares comprometidas con el linaje. Esta disrupción es un fenómeno complejo influenciado por varias señales regulatorias, incluida la cascada regulatoria Nrf2.

Para abordar las bases moleculares de estos cambios en la expresión genética inducidos por los vuelos espaciales, luego realizamos un análisis de secuencia de ARN de muestras de médula ósea. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que examina la expresión genética en la médula ósea de animales después de un vuelo espacial. También examinamos la influencia del agotamiento genético de Nrf2 en la expresión genética en la médula ósea de ratones después de un vuelo espacial.

Aplicamos los 2000 genes principales que se expresaron diferencialmente entre los cuatro grupos al algoritmo k-means de la aplicación iDEP.95 y los dividimos en tres grupos (Fig. 8a). El grupo I incluía genes cuyos niveles de expresión eran casi equivalentes en ratones GC-WT y GC-KO, así como en ratones FL-WT y FL-KO (n = 339). El grupo II incluía genes que estaban moderadamente regulados negativamente en ratones FL-WT y marcadamente regulados negativamente en ratones GC-KO en comparación con los ratones GC-WT, pero este grupo de genes estaba incluso más regulado negativamente en ratones FL-KO que en ratones GC-KO (n = 1465). El grupo III incluyó genes sin características tan específicas (n = 196).

a Análisis de conglomerados de DEG basado en el método de k-medias. b Análisis de enriquecimiento de GO específico del grupo. Los términos GO relacionados con la eritropoyesis (marcados con un fondo rosa) y el sistema inmunológico (marcados con un fondo naranja) están enriquecidos en los Grupos I y II, respectivamente. Se muestran el número de genes y los valores de p ajustados. c Diagrama de Venn de DEG regulados negativamente en la médula ósea para las comparaciones FL-WT frente a GC-WT (verde) y FL-KO frente a GC-KO (naranja). d Análisis GO de DEG regulados a la baja para las comparaciones FL-WT versus GC-WT (filas superiores) y FL-KO versus GC-KO (filas inferiores). Los términos GO relacionados con la eritropoyesis están marcados con un fondo rosa. Se muestran el número de genes y los valores de p ajustados. e Mapa de calor de la expresión relativa de genes relacionados con eritroides regulados negativamente en comparaciones de FL-WT frente a GC-WT (dos columnas de la izquierda) y FL-KO frente a GC-KO (dos columnas de la derecha). El valor medio obtenido para cada gen en ratones GC-WT se fijó en uno. Los DEG regulados a la baja en las comparaciones FL-WT frente a GC-WT y FL-KO frente a GC-KO están coloreados en azul. f, g Gráfico de puntos de la expresión de genes representativos relacionados con eritroides. Los puntos representan animales individuales. Las medias se muestran en los gráficos. *p < 0,05.

Luego realizamos análisis de vías basados ​​en los datos. Una observación intrigante fue que los términos GO relacionados con la eritropoyesis se enriquecieron en bloque en el Grupo I (Fig. 8b), mientras que un término GO correspondiente al proceso del sistema inmunológico se enriqueció más fuertemente en el Grupo II (Fig. 8b). No se identificó ningún término GO para el Grupo III.

Paralelamente, también realizamos análisis DEG. Encontramos 116 y 264 genes que estaban regulados negativamente en las comparaciones FL-WT versus GC-WT y FL-KO versus GC-KO, respectivamente (Fig. 8c). Como 78 genes estaban regulados negativamente en ambas comparaciones, 38 y 186 genes estaban específicamente regulados negativamente en las comparaciones FL-WT versus GC-WT y FL-KO versus GC-KO, respectivamente. El análisis GO de los genes regulados negativamente en ratones FL-WT y FL-KO reveló que varias subcategorías relacionadas con la eritropoyesis, incluido el "desarrollo de eritrocitos", el "proceso biosintético de compuestos que contienen porfirina" y el "proceso biosintético de tetrapirrol", se asociaron con una disminución de la expresión en ratones FL-WT y FL-KO. los grupos FL, independientemente de si los ratones tenían el fondo WT o Nrf2-KO (Fig. 8d).

Entre los DEG regulados negativamente por los vuelos espaciales, encontramos 29 genes que se clasificaron como genes relacionados con la eritropoyesis según los términos GO. Cuando realizamos una visualización del mapa de calor de los 29 genes, encontramos que Nrf2-KO redujo ligeramente la expresión de 19 de los 29 genes (Fig. 8e). Por ejemplo, los vuelos espaciales redujeron sustancialmente la expresión de los genes Slc6a9, Ank1, Cpox y Slc4a1 (Fig. 8f). Por el contrario, la ausencia de Nrf2 redujo gravemente la expresión de los 10 genes restantes y los vuelos espaciales suprimieron aún más la expresión de estos genes (Fig. 8e). Por ejemplo, la ausencia de Nrf2 disminuyó fuertemente la expresión de los genes Zfpm1 y Smarca4, y los vuelos espaciales exacerbaron estas disminuciones (Fig. 8g).

Al comparar la expresión del gen eritroide entre ratones WT y Nrf2-KO en condiciones de GC y FL por separado, observamos que la reducción de los genes eritroides en la condición FL fue amplificada por el estado de Nrf2-KO. Esta observación se realizó independientemente de la influencia de Nrf2-KO en la expresión del gen eritroide en condiciones del suelo (Figura complementaria 10). En conjunto, estos resultados demuestran que los vuelos espaciales suprimieron la expresión de un grupo de genes relacionados con los eritroides y que la deficiencia de Nrf2 amplificó la supresión del gen eritroide inducida por los vuelos espaciales en la médula ósea.

Por el contrario, la regulación positiva de la expresión genética inducida por los vuelos espaciales fue bastante rara. Mediante una inspección más cercana, encontramos 7 genes que estaban regulados positivamente en ratones FL-WT en comparación con ratones GC-WT, incluidas tres variantes diferentes de genes Stfa que codifican Stefin A1, A2 y A3 (Figura complementaria 11). La estefina A actúa como inhibidor de la cisteína proteasa y desempeña funciones importantes en muchos procesos biológicos, como la respuesta inmunitaria, la inflamación41 y la formación de trombos dependientes de plaquetas42. Este desequilibrio en la actividad proteolítica podría estar involucrado en los cambios fisiopatológicos causados ​​por los vuelos espaciales.

A continuación, quisimos investigar cómo el agotamiento de Nrf2 influye en los perfiles de expresión génica en células de la médula ósea de ratones que realizan vuelos espaciales. Con este fin, realizamos dos conjuntos de análisis DEG utilizando genes regulados negativamente en la médula ósea de ratones Nrf2-KO: GC-KO frente a GC-WT y FL-KO frente a FL-WT. Encontramos que 376 y 1034 genes disminuyeron debido a Nrf2-KO en condiciones de GC y FL, respectivamente (Fig. 9a). La cantidad de genes regulados negativamente por Nrf2-KO fue mucho mayor que la regulada negativamente por los vuelos espaciales, que fue 116 (Fig. 9a).

un diagrama de Venn de tres conjuntos de DEG regulados a la baja de las comparaciones GC-KO versus GC-WT (rosa), FL-KO versus FL-WT (azul) y FL-WT versus GC-WT (verde). Se muestran los números de genes en cada sección. El número verde representa el número de DEG superpuestos entre las tres comparaciones. El número de genes regulados negativamente en la comparación FL-WT frente a GC-WT que se superponen con los de las comparaciones GC-KO frente a GC-WT (rosa) y FL-KO frente a FL-WT (azul), excluyendo los DEG en la triple región superpuesta, se indican en rojo y azul, respectivamente. b Análisis GO de DEG regulados a la baja de las comparaciones GC-KO versus GC-WT (filas superiores) y FL-KO versus FL-WT (filas inferiores). Se muestran el número de genes y los valores de p ajustados. c Mapa de calor de la expresión relativa de 105 genes categorizados como "proceso del sistema inmunológico" entre los DEG regulados negativamente de la comparación GC-KO versus GC-WT. d Superposición de DEG regulados a la baja con valores de P ajustados para las comparaciones FL-WT versus GC-WT, GC-KO versus GC-WT y FL-KO versus FL-WT. El rojo, el azul y el verde corresponden a los genes de (a). Las dagas indican genes que codifican inmunoglobulinas y las dagas dobles indican genes que codifican factores relacionados con los procesos del sistema inmunológico. e Gráfico de puntos de los niveles de expresión de los genes Back2 y Rag1. Los puntos representan animales individuales. Las medias se muestran en los gráficos. *p < 0,05.

Es de destacar que 342 de 376 genes que disminuyeron en los ratones Nrf2-KO en condiciones de GC se redujeron concomitantemente en los ratones FL-KO, lo que indica que los genes regulados negativamente debido a Nrf2-KO en condiciones de GC estaban casi todos involucrados en el gen. grupo de 1034 genes regulados negativamente en condiciones de FL. Este resultado demuestra que el agotamiento genético de Nrf2 afecta más gravemente la homeostasis de la médula ósea en condiciones de vuelos espaciales que en condiciones terrestres y respalda nuestra afirmación de que Nrf2 desempeña un papel importante en la protección de la homeostasis durante los vuelos espaciales.

Descubrimos que el término GO "proceso del sistema inmunológico" se enriqueció significativamente entre los DEG regulados negativamente tanto en las comparaciones GC-KO versus GC-WT como entre FL-KO versus FL-WT (Fig. 9b). Cabe señalar que este término GO fue el más afectado en la comparación de las condiciones de los vuelos espaciales. Una inspección más cercana del mapa de calor que muestra que los genes relacionados con los procesos del sistema inmunológico disminuyeron en ratones GC-KO (es decir, 105 DEG) reveló que estos genes también mostraron una expresión disminuida en ratones FL-WT, y estas disminuciones se reprodujeron en ratones FL-KO ( Figura 9c). Estos resultados sugieren que las condiciones de los vuelos espaciales tienen un efecto similar a las condiciones de Nrf2-KO.

El hallazgo de que tanto Nrf2-KO como las condiciones de los vuelos espaciales provocaron una disminución en los genes relacionados con los procesos del sistema inmunológico nos llevó a examinar los detalles de estos cambios, incluso si estos cambios conducen a una supresión o activación inmune. Para abordar este punto, superpusimos 116 DEG regulados negativamente identificados en la comparación FL-WT versus GC-WT con aquellos regulados negativamente en las comparaciones GC-KO versus GC-WT y FL-KO versus FL-WT. Como se muestra en la Fig. 9a, un total de 17 de los 116 genes se superpusieron con aquellos regulados negativamente en las comparaciones de GC-KO frente a GC-WT y/o FL-KO frente a FL-WT. Entre estos 17 genes, 6 eran genes de inmunoglobulina y 6 eran genes que pertenecían a la firma del proceso del sistema inmunológico (Fig. 9d). Por ejemplo, los vuelos espaciales y Nrf2-KO indujeron de forma independiente y aditiva una disminución en la expresión de los genes Bach2 y Rag1, cuyos productos se sabe que desempeñan funciones importantes en el desarrollo linfoide43,44 (Fig. 9e). Por lo tanto, los vuelos espaciales disminuyen y el Nrf2-KO concomitante exacerba la expresión de genes inmunes en la médula ósea, lo que lleva a la inmunosupresión.

Se ha demostrado que los vuelos espaciales activan la expresión de genes diana Nrf2 en diversos tejidos y órganos18,20. Para abordar la cuestión de si este efecto de los vuelos espaciales también ocurre en la médula ósea y el bazo, comparamos los perfiles de expresión de los genes diana Nrf2 típicos en los cuatro grupos de ratones, es decir, GC-WT, FL-WT, GC-KO y FL-KO. Curiosamente, encontramos que la expresión de los genes diana Nrf2, que aumentaba principalmente en otros tejidos, no se activaba sino que disminuía en la médula ósea de los ratones FL-WT en comparación con los ratones GC-WT (Fig. 10a). La expresión de estos genes diana Nrf2 disminuyó fuertemente en los ratones GC-KO y FL-KO en comparación con los ratones GC-WT y FL-WT (Fig. 10a). En marcado contraste, la expresión de los genes diana de Nrf2 en el bazo fue comparable en los cuatro grupos (Fig. 10b), lo que indica que ni Nrf2-KO ni los vuelos espaciales influyeron sustancialmente en la expresión de los genes diana de Nrf2 en el bazo. Estos hallazgos implican que, mientras que en la mayoría de los tejidos, los vuelos espaciales inducen la actividad de Nrf2 y Nrf2 protege contra las perturbaciones de la homeostasis provocadas por los vuelos espaciales, en la médula ósea, la activación de Nrf2 por los vuelos espaciales es bastante débil y no puede mantener completamente la homeostasis. En el bazo, la contribución de Nrf2 es limitada incluso en condiciones basales.

a, b Mapa de calor de la expresión relativa de los genes diana Nrf2 en la médula ósea (a) y el bazo (b) de ratones GC-WT, FL-WT, GC-KO y FL-KO. El valor medio de cada gen en ratones GC-WT se estableció en uno en cada panel. c Gráfico de puntos de la expresión de los genes Gclm, Gclc, Nqo1 y Srxn1 en la médula ósea. Los puntos representan animales individuales. Las medias se muestran en los gráficos. *p < 0,05. d Gráficos de caja y puntos de la expresión de los genes Sclm, Gclc, Nqo1 y Smarca4 en la médula ósea. Se realizaron pruebas unilaterales de suma de rangos de Wilcoxon para evaluar las diferencias entre Nrf2-KO y ratones WT de control en condiciones de tierra (parte izquierda en cada panel) y de vuelo espacial (parte derecha). *P<0,05.

Encontramos cuatro genes cuya expresión se redujo significativamente en ratones FL-WT en comparación con ratones GC-WT (Fig. 10c). Se sabe que los productos de los genes Gclm, Gclc, Nqo1 y Srxn desempeñan funciones importantes en la vía de regulación redox45,46. Estos hallazgos demuestran que la médula ósea es bastante sensible al estrés relacionado con los vuelos espaciales. Sorprendentemente, si bien los vuelos espaciales disminuyeron sustancialmente la expresión de los genes Gclm, Gclc, Nqo1 y Srxn, la ausencia concomitante de Nrf2 endógeno disminuyó aún más las expresiones de esos genes (Fig. 10c, d). Si bien las células de la médula ósea pueden protegerse parcialmente mediante el aumento de la actividad endógena de Nrf2, la magnitud de la inducción de Nrf2 por los vuelos espaciales per se parece no ser suficiente, por lo que los fenotipos de supresión hematopoyética e inmune se vuelven evidentes, y los inductores de Nrf2 pueden ayudar a proteger a los humanos durante el espacio. viajar.

En este estudio, realizamos evaluaciones hematológicas e inmunológicas de los ratones de la misión MHU-3, que envió al espacio seis ratones Nrf2-KO y seis ratones WT. Para superar las dificultades inherentes al estudio espacial, hemos incorporado varios desafíos experimentales en este estudio. Como resultado, descubrimos que Nrf2 no ​​influye mucho en la protección de la eritropoyesis durante los vuelos espaciales. Por el contrario, Nrf2 desempeña importantes funciones protectoras en el sistema inmunológico durante los vuelos espaciales. De hecho, la supresión de la expresión genética relacionada con el sistema inmunológico inducida por los vuelos espaciales se ve notablemente potenciada por el agotamiento genético de Nrf2, mientras que las reducciones inducidas por los vuelos espaciales en la expresión del gen eritroide son significativas en el bazo y la médula ósea, independientemente del nivel de expresión de Nrf2. Por lo tanto, estos hallazgos indican que Nrf2 contribuye al mantenimiento del sistema inmunológico durante los vuelos espaciales y sugieren que mejorar el nivel de actividad inicial de Nrf2 alivia el grado de supresión inmune durante los vuelos espaciales. Suponemos que este hallazgo es particularmente importante para una mayor exploración del espacio más allá de la ISS. Si consideramos los próximos planes para desarrollar los viajes espaciales, la radiación cósmica en la EEI es leve y una estancia de un mes en la EEI es corta. Por tanto, creemos que la importancia de la activación de Nrf2 durante los viajes espaciales debería estudiarse más a fondo y con más detalle.

En este estudio, demostramos que los vuelos espaciales tienen el potencial de aumentar el riesgo de microangiopatía trombótica, acompañada de alteraciones del sistema de coagulación y fibrinólisis. Desde que se identificó la trombosis de la vena yugular interna como una enfermedad asociada a los viajes espaciales47, la regulación de la coagulación durante los vuelos espaciales ha sido una preocupación48,49,50. En este estudio, encontramos aumentos en MPV y PDW en ratones FL. Aunque el número de plaquetas se mantuvo sin cambios, es concebible que los aumentos en MPV y PDW representen una tasa de renovación de plaquetas acelerada. También observamos una tendencia creciente en la expresión del vWF en varios tejidos de ratones FL. El vWF es un factor bien conocido que desempeña un papel central en la trombosis causada por inflamación34,51. La activación de la expresión del gen vWF inducida por los vuelos espaciales pareció acelerarse en combinación con el fondo Nrf2-KO, lo que implica que Nrf2 participa en la protección contra la inflamación y las lesiones endoteliales52.

También se observa una expresión elevada de genes implicados en la vía fibrinogenolítica de congelación en el hígado de ratones FL, acompañada de una expresión elevada de genes Stfa, un sello distintivo de la activación plaquetaria, en la médula ósea42. Hasta donde sabemos, estos son los primeros análisis del sistema de coagulación y fibrinólisis en ratones después de un vuelo espacial, y prevemos que la coagulación intravascular se activa durante el vuelo espacial y, en consecuencia, la expresión de los genes que codifican las proteínas de coagulación y fibrinogenolíticas se eleva a compensar su consumo53. Un punto importante aquí es que los cambios inducidos por los vuelos espaciales en la vía fibrinogenolítica de congelación se ven potenciados por Nrf2-KO, lo que sugiere que Nrf2 contribuye, al menos en parte, a proteger la trombosis intravascular durante los vuelos espaciales.

Se ha considerado que la elevación de los valores de Hct en los astronautas durante la fase inicial de los viajes espaciales se debe a la reducción del volumen plasmático causada por el ajuste del equilibrio de líquidos corporales a la microgravedad54. Si bien se encuentran valores elevados de Hct durante el período inicial de una estadía en el transbordador espacial9, la policitemia se revierte gradualmente mediante la adaptación hematopoyética a la microgravedad11, acompañada de un aumento de la hemólisis10,12. Al volver a la gravedad normal, se produce una redistribución de los fluidos corporales, junto con un aumento del flujo sanguíneo circulante, lo que provoca anemia post-vuelo9. Por tanto, los astronautas que permanecen más tiempo en microgravedad desarrollan una anemia más grave12. En marcado contraste, los ratones no muestran policitemia en L + 18 en la ISS, sino que se encuentra un marcado aumento en la masa de glóbulos rojos después del aterrizaje. Suponemos que las siguientes diferencias entre ratones y humanos pueden ser pertinentes para esta discrepancia. Una es que la vida útil de los eritrocitos de ratón es de aproximadamente 40 días, que es 1/3 más corta que la de los eritrocitos humanos55; por tanto, los ratones pueden completar la adaptación eritropoyética más rápidamente que los humanos durante su estancia en microgravedad. La otra es que el impacto de la microgravedad en los valores de Hct puede ser diferente entre animales bípedos y cuadrúpedos.

A través de una serie de estudios MHU-3, descubrimos que Nrf2 desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis del metabolismo de los lípidos en respuesta al estrés de los vuelos espaciales8,20,21. Teniendo en cuenta que los lípidos sirven como fuente de combustible para la mielopoyesis en la médula ósea56, es posible plantear la hipótesis de que la inmunosupresión inducida por los vuelos espaciales y la deficiencia de Nrf2 puede estar mediada por un metabolismo lipídico alterado.

Este estudio ha aclarado que los vuelos espaciales afectan tanto al sistema eritroide como al inmunológico del bazo y la médula ósea, pero las influencias parecen ser distintas entre estos dos órganos. En ratones, el bazo es un órgano hematopoyético que desempeña funciones críticas en la eritropoyesis por estrés, mientras que la médula ósea exhibe una hematopoyesis equilibrada tanto en condiciones de estado estacionario como de estrés. Por el contrario, la médula ósea es el único órgano hematopoyético auténtico en los seres humanos. De acuerdo con estudios anteriores37,57, en este estudio encontramos que el tamaño del bazo disminuye en ratones FL. Un examen más detenido del bazo en ratones FL reveló además que la pulpa blanca se redujo significativamente. Dado que la pulpa blanca es el sitio donde residen las células mieloides y linfoides, esta observación respalda aún más la idea de que los vuelos espaciales inducen inmunosupresión. Los análisis de ratones Nrf2-KO revelaron que la desactivación de Nrf2 no ​​influye en la expresión de los genes diana de Nrf2 en el bazo de ratones FL o GC.

Por el contrario, descubrimos que el tamaño de la pulpa roja no cambió mucho después del vuelo espacial. En este contexto, la expresión de GATA1 y genes eritroides relacionados se regula a la baja después de los vuelos espaciales37. Una explicación plausible para estas observaciones es que mientras los humanos desarrollan anemia después del vuelo, los ratones desarrollan policitemia. Por lo tanto, en respuesta al aumento en el número de glóbulos rojos, la expresión de GATA1 y de los genes eritroides puede disminuir. Alternativamente, podrían ocurrir cambios en la expresión del gen eritroide durante la transición de la microgravedad a la normogravedad, lo que explica por qué el tamaño de la pulpa roja no cambió mucho en el momento del análisis.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de JAXA (números de protocolo 017-001 y 017-014), NASA (número de protocolo FLT-17-112), Explora BioLabs (EB15-010C) y la Universidad de Tohoku ( 2017MdA-328) y realizado de acuerdo con las directrices relacionadas y las leyes aplicables de Japón y los Estados Unidos de América. Los ratones macho Nrf2-KO y WT proporcionados para el proyecto MHU-3 y los experimentos de GC se seleccionaron después de una aclimatación de 3 semanas en jaulas individuales, según el estado de salud18,21. La extracción de sangre del extremo distal de la cola se realizó con cortaúñas (KAI, PQ3357)18,21. Los índices hematopoyéticos de la sangre extraída de IVC se midieron con autohemocitómetros VetScan HM5 (Abaxis) en la costa oeste de EE. UU. y con autohemocitómetros Celltac-α MEK6450 (Nihon Koden) en Japón. Las células de la médula ósea recogidas de la pelvis y la tibia derechas se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se aislaron suspensiones de células mononucleares de bazo mediante filtración a través de un filtro celular de 100 μm (Corning) para eliminar fragmentos de tejido. Después de lavar con PBS una vez, los sedimentos celulares se resuspendieron en CELLBANKER2 (ZENOAQ RESORCE). Después de dividir las muestras en tres tubos, cada alícuota de suspensión celular se congeló en hielo seco y se criopreservaó en nitrógeno líquido.

Cada bazo se dividió transversalmente en tres piezas y una pieza central se fijó en Mildform 10 N (Wako), seguido de su inclusión en parafina. Se prepararon dos secciones de 3 µm de espesor de cada muestra y se tiñeron con hematoxilina-eosina. Las imágenes se escanearon con SLIDEVIEW VS200 (Olympus) y se procesaron con el software QuPath (v.0.3.2)38. Para cuantificar las células WP y RP, se utilizó un algoritmo para la detección de células en el programa de detección de células incorporado de QuPath, con imágenes representativas en las que las áreas de WP y RP se seleccionaron manualmente, y luego se realizó el programa de clasificación de células de QuPath siguiendo el algoritmo.

Las células criopreservadas se descongelaron rápidamente a 37 °C y se transfirieron inmediatamente a DMEM con alto contenido de glucosa (Nacalai) con suero bovino fetal (FBS) al 20 %. Después de lavar una vez con medio, las células se lavaron una vez más con PBS. El agotamiento del linaje se realizó utilizando un cóctel de anticuerpos biotinilados contra Ter119, B220, Gr1, CD8, CD4, CD11b y CD127, cada uno a una concentración de 1,0 μg/ml, seguido de la eliminación utilizando perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina Dynabeads M-280 (Thermo Fisher Científico). Las células se marcaron con anticuerpos marcados con fluorescencia a una concentración de 1,0 μg/ml y se incubaron en hielo en la oscuridad durante 20 minutos. Posteriormente, las células se sometieron a dos lavados con PBS y luego se resuspendieron en PBS que contenía FBS al 2%. La exclusión de desechos se logró mediante la creación de un gráfico que representa la relación entre el área de dispersión frontal (FSC) (A) y la dispersión lateral (SSC) -A. Para excluir las células dobletes, se empleó un gráfico que representa la altura del FSC (H) frente al ancho del FSC (W), seguido de otro gráfico que muestra el SSC-H frente al SSC-W. La exclusión de células muertas se logró mediante la utilización de 7-amino-actinomicina D (BD Biosciences). Los detalles de los anticuerpos marcados con fluorescencia utilizados para los análisis de citometría de flujo se muestran en la Tabla complementaria 1 y las estrategias de activación se proporcionan en Métodos complementarios. Las células teñidas se filtraron a través de un filtro de 35 μm (FALCON) y se analizaron con el software BD FACSAria II y BD FACSDiva (Becton Dickinson).

El ARN total se aisló de las células criopreservadas de la médula ósea en líquido CELLBANKER2 añadiendo directamente 3 ml de ISOGEN-LS (NIPPON GENE) a temperatura ambiente. La integridad del ARN se evaluó utilizando una TapeStation Agilent 2200. Se sometieron doscientos nanogramos de ARN total a la preparación de una biblioteca de ADNc utilizando el conjunto de preparación de biblioteca direccional de ARN (MGI) MGIEasy. Las bibliotecas se secuenciaron utilizando DNBSEQ-G400 (MGI). Las lecturas sin procesar se asignaron al genoma mm10 del ratón utilizando STAR (versión 2.6.1)58. Se obtuvieron valores de transcripciones por millón (TPM) para medir la expresión génica utilizando RSEM (versión 1.3.1)59. Los valores de TPM de muestras de bazo se obtuvieron de un conjunto de datos publicado previamente18. El TPM se normalizó en iDEP.9539. En análisis adicionales se incluyeron genes con un TPM superior a uno en al menos una muestra. La agrupación de k-medias fue realizada por iDEP.95. Los DEG se analizaron con un límite de tasa de descubrimiento falso <0,1 y un límite de cambio de veces ≥2 utilizando iDEP.95. Los mapas de calor de análisis global se produjeron utilizando paquetes heatmap.3 y gplots basados ​​en R.

Los puntos de datos representan réplicas biológicas. Para evaluar las diferencias entre los grupos GC-WT, FL-WT, GC-KO y FL-KO, se realizaron las pruebas de Kruskal-Wallis. En los casos en los que el valor p era inferior a 0,05, se realizaron más comparaciones múltiples Steel-Dwass para evaluar las diferencias entre los cuatro grupos. Para comparar los cambios en el curso del tiempo en los valores de hematocrito, se empleó una prueba de rangos con signo de Wilcoxon de dos colas por pares. Para evaluar las disparidades entre los ratones Nrf2-KO y los ratones WT de control en condiciones tanto terrestres como de vuelos espaciales, se realizaron de forma independiente pruebas de suma de rangos de Wilcoxon unilaterales. El análisis estadístico se realizó utilizando el software JMP Pro 16 (SAS Institute).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos representados en esta publicación se han depositado en Gene Expression Omnibus60 del NCBI y se puede acceder a ellos a través del número de acceso de la serie GEO (GSE240654). Los Datos Suplementarios 1 incluyen los datos fuente correspondientes a los gráficos presentados en las figuras principales y en las figuras complementarias. Todos los datos relevantes están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

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Agradecemos a los Dres. Osamu Funatsu, Michihiko Shimomura y Hiroyasu Mizuno por coordinar la investigación, y a la Sra. Aya Ashizawa por su ayuda técnica. También agradecemos al Núcleo de Investigación Biomédica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Tohoku por su apoyo técnico. Este trabajo fue seleccionado como un estudio de investigación de roedores espaciales para los experimentos de viabilidad de JAXA utilizando ISS/Kibo anunciados en 2015, y también apoyado en parte por MEXT/JSPS KAKENHI (19H03555 a RS, 19H05649 a MY y 18H04963 a T. Suzuki), BINDS /AMED (JP22ama121038 a MY) y el Centro de Investigación de Envejecimiento Inteligente, Universidad de Tohoku (MY). Este trabajo también fue financiado en parte por las subvenciones JP19km0105001 y JP19km0105002.

Organización Tohoku Medical Megabank, Universidad de Tohoku, Sendai, Japón

Ritsuko Shimizu, Atsushi Hasegawa, Akihito Otsuki, Keiko Taguchi, Fumiki Katsuoka, Akira Uruno, Takafumi Suzuki y Masayuki Yamamoto

Departamento de Hematología Molecular, Facultad de Medicina de la Universidad de Tohoku, Sendai, Japón

Ritsuko Shimizu, Ikuo Hirano y Mikiko Suzuki

Centro de Investigación Avanzada para Innovaciones en Medicina de Próxima Generación (INGEM) Universidad de Tohoku, Sendai, Japón

Ritsuko Shimizu, Mikiko Suzuki, Keiko Taguchi, Fumiki Katsuoka y Masayuki Yamamoto

División de Biología del Oxígeno, Centro de Criaderos para la Creación de Nuevas Industrias (NICHe), Universidad de Tohoku, Sendai, Japón

Norio Suzuki

Centro de Utilización del Módulo Experimental Japonés (JEM), Dirección de Tecnología de Vuelos Espaciales Tripulados, Agencia de Exploración Aeroespacial de Japón (JAXA), Tsukuba, Japón

Akane Yumoto, Risa Okada, Masaki Shirakawa y Dai Shiba

Departamento de Anatomía y Embriología y Centro de Recursos para Animales de Laboratorio en el Centro de Investigación Médica Transfronteriza, Instituto de Medicina, Universidad de Tsukuba, Tsukuba, Japón

Satoru Takahashi

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RS, IH, AH y MY escribieron el artículo. AY, RO, Ma.S y DS realizaron los experimentos espaciales. RS, IHAH, MS, AO, KT, FK, AU, NS, ST y TS realizaron las evaluaciones moleculares, histológicas y fisiológicas y analizaron los datos. MY supervisó el proyecto.

Correspondencia a Ritsuko Shimizu o Masayuki Yamamoto.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Sarmistha Saha y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal: Joao Valente.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Shimizu, R., Hirano, I., Hasegawa, A. et al. Nrf2 alivia la inmunosupresión y la microangiopatía trombótica inducida por vuelos espaciales en ratones. Común Biol 6, 875 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05251-w

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Recibido: 26 de febrero de 2023

Aceptado: 17 de agosto de 2023

Publicado: 25 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05251-w

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