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Aug 08, 2023

Desarrollo de un biobanco de Plasmodium vivax para ensayos funcionales ex vivo

Malaria Journal volumen 22, número de artículo: 250 (2023) Cite este artículo 1 Detalles de Altmetric Metrics Plasmodium vivax es la segunda causa más prevalente de malaria, pero su estudio sigue siendo un desafío debido

Malaria Journal volumen 22, Número de artículo: 250 (2023) Citar este artículo

1 altmétrica

Detalles de métricas

Plasmodium vivax es la segunda causa más frecuente de malaria, pero su estudio sigue siendo un desafío debido a la falta de un sistema de cultivo in vitro continuo, lo que destaca la necesidad de establecer un biobanco de aislados clínicos con múltiples congelaciones por muestra para su uso en ensayos funcionales. Se compararon diferentes métodos para criopreservar aislamientos de parásitos y posteriormente se validó el más prometedor. Se cuantificó el enriquecimiento de los parásitos en etapa temprana y tardía y la maduración de los parásitos para facilitar la planificación del ensayo.

Para comparar los protocolos de criopreservación, se congelaron nueve aislados clínicos de P. vivax con cuatro mezclas a base de glicerolitos. La recuperación del parásito después de la descongelación, después del enriquecimiento con KCl-Percoll y en cultivos in vitro a corto plazo se midió mediante microscopía en portaobjetos. Se midió el enriquecimiento de parásitos en etapa tardía mediante clasificación de células activadas magnéticamente (MACS). También se comparó el almacenamiento de parásitos a corto y largo plazo a -80 °C o nitrógeno líquido.

De las cuatro mezclas de criopreservación, una mezcla (glicerolito:suero:RBC en una proporción de 2,5:1,5:1) dio como resultado una mejor recuperación del parásito y una mejora estadísticamente significativa (P <0,05) en la supervivencia del parásito en cultivos in vitro a corto plazo. Posteriormente se generó un biobanco de parásitos utilizando este protocolo, lo que dio como resultado una colección de 106 aislados clínicos, cada uno con 8 viales. La calidad del biobanco se validó midiendo varios factores de 47 deshielos: la reducción media de la parasitemia post-descongelamiento (25,3%); el promedio de enriquecimiento posterior a KCl-Percoll (6,65 veces); y el porcentaje promedio de recuperación de parásitos (22,0%, medido a partir de 30 aislamientos). Durante el cultivo in vitro a corto plazo, se observó una maduración robusta de los parásitos en etapa de anillo a etapas posteriores (> 20 % de trofozoítos, esquizontes y gametocitos) en el 60,0 % de los aislados a las 48 h. El enriquecimiento de los estadios de parásitos maduros mediante MACS mostró una buena reproducibilidad, con un promedio de 30,0% de parasitemia post-MACS y un promedio de 5,30 × 105 parásitos/vial. Finalmente, se probó el efecto de la temperatura de almacenamiento y no se observaron grandes impactos del almacenamiento a corto plazo (7 días) o largo plazo (7 a 10 años) a -80 °C en la recuperación, el enriquecimiento o la viabilidad de los parásitos.

Aquí, se demuestra un método de congelación optimizado para aislados clínicos de P. vivax como plantilla para la generación y validación de un biobanco de parásitos para su uso en ensayos funcionales.

Plasmodium vivax es la especie de parásito de la malaria más extendida geográficamente y es responsable de la segunda carga más alta de malaria a nivel mundial. Si bien la incidencia total de P. vivax ha disminuido a nivel mundial de 20,5 millones de casos en 2000 a 4,9 millones de casos en 2021 [1], persisten obstáculos importantes en los esfuerzos por erradicar este patógeno, incluida la falta de una vacuna contra P. vivax y la creciente resistencia a medicamentos contra la malaria.

La investigación sobre la biología fundamental de P. vivax se ha visto muy limitada debido a la falta de un sistema de cultivo in vitro continuo [2,3,4]. Esta falta de cultivo continuo requiere el uso de aislamientos clínicos de P. vivax para investigaciones experimentales, y el acceso limitado a estos aislamientos ha obstaculizado el avance del conocimiento sobre este parásito. Recientemente, se han establecido enfoques de cultivo in vitro a corto plazo para P. vivax (incluido en algunos casos el uso de aislados criopreservados) [3, 5, 6], lo que permite realizar ensayos de resistencia a fármacos de ciclo único [3, 7] así como ensayos de invasión para evaluar el tropismo de los reticulocitos del huésped [8], los efectos de los anticuerpos inhibidores de la invasión [9,10,11,12,13,14,15,16] y los mutantes del receptor del huésped [17, 18]. Cada vez se reconoce más la importancia de almacenar en biobancos muestras de enfermedades infecciosas [19,20,21], incluido Plasmodium falciparum [22,23,24]. La generación de un biobanco de aislados de P. vivax criopreservados que puedan descongelarse de manera confiable para la experimentación posterior (ensayos funcionales, ensayos de expresión génica, genómica) sería un recurso fundamental para futuros avances en el campo [4].

La criopreservación de parásitos de la malaria en etapa sanguínea tiene una larga historia; los primeros estudios se basaban en la congelación rápida a temperaturas de hielo seco o nitrógeno líquido y la rápida descongelación de los glóbulos rojos [25, 26] (revisado en [27]). Estos primeros experimentos se realizaron sin crioprotectores y dieron como resultado una baja recuperación de parásitos y altos niveles de lisis de glóbulos rojos. La mayoría de los métodos modernos utilizan soluciones crioprotectoras a base de glicerol que mejoraron la recuperación de glóbulos rojos [28,29,30,31], mientras que una minoría ha utilizado dimetilsulfóxido (DMSO) [30, 31] (archivo adicional 1: Tabla S1). Se han informado varios métodos de criopreservación para P. vivax [5, 7, 32,33,34,35,36], la mayoría basados ​​en la adición de diversas proporciones de solución tamponada de glicerol/lactato al 57 % (Glycerolyte 57) a glóbulos rojos empaquetados. Sin embargo, hasta la fecha no ha habido una comparación sistemática de la efectividad de estos diferentes métodos de criopreservación para P. vivax, en gran parte debido al material de investigación limitado de aislados clínicos.

En este caso, se utilizó una fuente continua de aislamientos de P. vivax de pacientes del Goa Medical College and Hospital en Goa, India, para comparar la eficacia de cuatro enfoques de criopreservación diferentes. Luego se estableció un biobanco experimental de aislados criopreservados de P. vivax, y estas muestras se utilizaron para validar la eficiencia de la recuperación de parásitos después de la descongelación, el enriquecimiento de parásitos en etapa temprana mediante sedimentación de densidad KCl-Percoll [3, 37], la maduración de parásitos en cultivo in vitro a corto plazo y el enriquecimiento de parásitos en etapa madura después de MACS [38]. Además, se probaron los efectos de los ciclos de temperatura entre −80 °C (hielo seco/congelador) y −196 °C (nitrógeno líquido) para modelar los cambios de temperatura que ocurren durante el transporte de muestras congeladas a corto y largo plazo. almacenamiento. Estos resultados servirán de base para la criopreservación y el transporte futuros de muestras de P. vivax y ayudarán en el establecimiento de biobancos criopreservados para futuros esfuerzos experimentales con este parásito poco estudiado.

El protocolo de sujetos humanos y los formularios de consentimiento para inscribir a pacientes infectados por Plasmodium en este estudio en Goa Medical College and Hospital (GMC) fueron revisados ​​y aprobados por las Juntas de Revisión Institucional de la División de Microbiología y Enfermedades Infecciosas (DMID) del Instituto Nacional de EE. UU. de Alergias y Enfermedades Infecciosas (aprobación DMID 11-0074), la Universidad de Washington (aprobación 42271/1192), así como el Comité de Ética Institucional (IEC) del Goa Medical College Hospital, Bambolim, Goa, India.

El estudio se llevó a cabo en el Goa Medical College Hospital, en el laboratorio de Malaria Evolution in South Asia-International Centers for Excellence in Malaria Research. Se extrajo sangre venosa en tubos vacutainer de 6 ml (solución anticoagulante de dextrosa ácida; BD India, #364606) de todos los pacientes con frotis positivo para monoinfección por P. vivax con consentimiento informado firmado entre 12 meses y 65 años de edad de 2013 a 2019. Se excluyeron de la inscripción las pacientes embarazadas (autoinformadas) y anémicas.

Se recogieron muestras clínicas que dieron positivo para P. vivax mediante una prueba de diagnóstico rápido (FalciVax, Zephyr Biomedicals #50300025, Goa, India) y se prepararon y tiñeron frotis usando Field Stains A (Himedia India, #S008) y B (Himedia India, #S009). Se incluyeron muestras con parasitemia > 0,01% para análisis posteriores. La sangre se centrifugó a 800 g durante 5 minutos a temperatura ambiente, y el suero de cada aislado se separó y almacenó a -80 °C para estudios relacionados. La sangre sedimentada se lavó usando solución salina tamponada con fosfato (Thermo Fisher Scientific, EE. UU., n.° J61196.AP) suplementada con albúmina de suero bovino al 0,5 % (p/v) (Millipore Sigma EE. UU., n.° 10735086001) para separar los componentes del suero sobrantes. Antes de la criopreservación, la sangre sedimentada se separó de los leucocitos pasando la muestra a través de filtros de columna CF-11 preparados en el laboratorio. Los frotis se prepararon después del procesamiento con CF-11 para evaluar los estadios del parásito y examinar la eliminación de leucocitos. Las muestras deleucocitadas se criopreservaron usando Glycerolyte 57 (Baxter/Fenwal USA, #4A7833), agregado de la siguiente manera: la proporción de glicerolito 57:suero:RBC fue de 2:0:1 para la mezcla 1 [7], 2,5:1,5:1 para la mezcla 2 [35, 39], 1,66:0:1 para la mezcla 3 [36] y 4,15:1,5:1 para la mezcla 4. Las muestras se almacenaron en crioviales (Fisher Scientific USA, #50001020) a −80 °C durante 24 h antes. al almacenamiento a largo plazo en criotanques de nitrógeno líquido a -196 °C. El suero utilizado en el estudio fue plasma combinado AB+ inactivado por calor (Access Biologicals, EE. UU., n.° A17054) recolectado de una región no endémica de malaria.

Los aislados de Plasmodium vivax se descongelaron utilizando un protocolo estándar [39]. Las muestras se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37 °C, seguido de la adición gota a gota de 1/10 del volumen de NaCl al 12 % (p/v) (Himedia India, #TC046) y 10 volúmenes de NaCl al 1,6 % (p/v). Posteriormente, las muestras se sedimentaron a 500 g durante 5 minutos y luego se lavaron 2 veces con medio IMDM + glutamax (Thermo Fisher Scientific, EE. UU., n.º 31980030). Los parásitos se enriquecieron utilizando gradientes de KCL Percoll de 1,080 g/ml [3, 37] (Percoll: Cytiva/Millipore Sigma #17-5445-01; KCl: Himedia India, #TC010). Se colocaron tres mililitros de la muestra en medio (entre 20 y 25 % de hematocrito) en un volumen igual de 1,080 g/ml de KCl Percoll a temperatura ambiente en un tubo de centrífuga de 15 ml. La muestra en capas se centrifugó a 1200 g durante 15 minutos con aceleración lenta y sin freno. Los parásitos enriquecidos de la interfaz Percoll se lavaron en IMDM + glutamax + 0,5% (p/v) de BSA y posteriormente se cultivaron en IMDM + 10% (v/v) AB + suero inactivado por calor con 0,5% (v/v) gentamicina (Thermo Fisher Scientific, EE. UU. n.° 15750060) por condición en volúmenes de 1 ml en placas de 24 pocillos (Nunc/Thermo Fisher Scientific, EE. UU., n.° 144530). Los hematocritos oscilaron entre 0,2 y 3,5% con un promedio de 1,8%. Las placas se incubaron a 37 °C y con una mezcla de gases (combinación de 5% CO2, 10% O2 y 85% N2) en cámaras de incubación modulares (Billups Rothenberg, EE. UU., #MIC-101) durante 24 a 72 h, según fuera necesario para la evaluación de datos. El enriquecimiento de parásitos a través de MACS se realizó como se informó anteriormente [40].

Los portaobjetos para los experimentos se contaron en un microscopio óptico usando un objetivo de 100X con inmersión en aceite con una retícula de 1:4 en un microscopio Zeiss Primo Star. Los portaobjetos se contaron y se accedió a las etapas utilizando el método de campo completo [41] en múltiples campos (15 a 20 campos) hasta que se contaron 500 glóbulos rojos en la pequeña caja de la retícula 1:4. Los portaobjetos para los diferentes puntos temporales durante el experimento se prepararon utilizando un cytospin (Shandon/Thermo Scientific) con 100 µl de albúmina sérica bovina al 10 % (p/v) en PBS. La parasitemia se calculó como:

donde el factor de campo total para la retícula 1:4 era 10,9.

Todos los datos de los experimentos se analizaron utilizando Microsoft Excel y Graphpad Prism (versión 9.8.14). Las comparaciones entre las condiciones experimentales se realizaron mediante análisis ANOVA unidireccional (o cuando faltaban datos de portaobjetos debido a portaobjetos ilegibles mediante análisis de modelo de efectos mixtos). El análisis se realizó con emparejamiento por aislamiento del parásito, con el supuesto de una distribución gaussiana de residuos y el supuesto de esfericidad. Se utilizó la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para determinar diferencias estadísticamente significativas entre conjuntos individuales de condiciones. Los datos primarios de todos los resultados se pueden encontrar en el archivo adicional 2.

Entre las personas positivas a la malaria que se presentan en el Goa Medical College and Hospital (GMC), más del 80% están infectadas con P. vivax [42]. La capacidad de recolectar esta cantidad de aislamientos de P. vivax ha convertido a GMC en un entorno único para desarrollar un biobanco de parásitos criopreservados para futuras experimentaciones. De 2012 a 2016, se criopreservaron más de 700 aislamientos de P. vivax utilizando el método de Kosaisavee et al. [7], donde se utilizó una proporción de 2:1 de glicerolito crioprotector: eritrocitos. En la literatura se han informado otras proporciones de glicerolito: eritrocitos para la criopreservación tanto de P. falciparum como de P. vivax (archivo adicional 1: Tabla S1). Se probaron cuatro mezclas de criopreservación, derivadas de protocolos de criopreservación establecidos [7, 34, 36, 39] (Fig. 1A) que variaban en las proporciones de glicerolito: eritrocitos (con o sin adición de suero) para identificar cualquier diferencia. de la proporción establecida de glicerolito:RBC de 2:1.

Comparación de cuatro mezclas de congelación diferentes. A Se criopreservaron nueve aislados clínicos de P. vivax utilizando cuatro mezclas con diferentes proporciones de glóbulos rojos, suero y glicerolito. La comparación de la parasitemia B posterior a la descongelación, la parasitemia C posterior a KCl-Percoll y la parasitemia D de 24 h, todas normalizadas a los valores de la mezcla 1. *P < 0,05 mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Dunnett

Nueve aislados de P. vivax se dividieron en 4 porciones iguales y cada una se criopreservaó utilizando una de las mezclas. Después de un mínimo de 1 semana de almacenamiento en nitrógeno líquido, estas muestras se descongelaron utilizando métodos estándar [39] y la parasitemia se determinó mediante microscopía en portaobjetos después de la descongelación, después del enriquecimiento mediante gradientes de densidad de KCl-Percoll [3, 37] y a las 24 h en breve. -término cultura ex vivo. Los valores de parasitemia se normalizaron con los valores de la mezcla 1 en cada paso. Después de la descongelación (Fig. 1B), se observó un aumento en la parasitemia relativa para la mezcla 2, pero esto no alcanzó significación estadística. Después del enriquecimiento con KCl-Percoll (Fig. 1C), las mezclas 2, 3 y 4 mostraron una parasitemia relativa mayor que la mezcla 1, pero nuevamente no alcanzaron significación estadística. A las 24 h en cultivo a corto plazo (Fig. 1D), se observó un aumento estadísticamente significativo en la parasitemia relativa para la mezcla 2 en comparación con la mezcla 1 (P = 0,0123, F (1,781, 12,47) = 6,690 mediante ANOVA unidireccional con datos emparejados. datos y prueba de comparaciones múltiples de Dunnett). En conjunto, estos datos demostraron que la criopreservación de aislados de P. vivax con la mezcla 2 dio como resultado una mejor recuperación y maduración de los parásitos y se eligió esta formulación de criopreservación para el establecimiento de un biobanco mejorado.

Se han criopreservado más de cien aislados de P. vivax utilizando la mezcla 2, con un promedio de 8 viales generados por muestra (~ 300 µl de glóbulos rojos envasados/vial). Las parasitemias iniciales oscilaron entre el 0,036 y el 1,526% con una mediana del 0,323% y la media del 0,384% (fig. 2A). Dentro de las muestras recolectadas, los valores medios de parasitemia fueron más altos para los estadios de anillos (anillos tempranos (0,212%); anillos tardíos (0,071%)) en comparación con otros estadios: trofozoítos tempranos (0,044%); trofozoitos tardíos (0,008%); esquizontes (0,005%) y gametocitos (0,040%) (Fig. 2B).

Caracterización de biobanco y enriquecimiento de anillos mediante KCl-Percoll. Un rango de valores de parasitemia previa a la congelación para 106 aislados criopreservados. B Distribución de las diferentes etapas de precongelación. C Comparación de los valores de parasitemia antes de la congelación, después de la descongelación y después de KCl-Percoll para 47 aislamientos. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 mediante ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples de Tukey. Los gráficos circulares inferiores muestran la proporción de muestras con parasitemias ≥ 0,2%. D Distribución de enriquecimientos posteriores a KCl-Percoll. E Distribución del porcentaje de recuperación de parásitos durante el enriquecimiento con KCl-Percoll

Tanto los ensayos de resistencia a medicamentos como de invasión con aislados de P. vivax requieren una cantidad suficiente de parásitos para realizar mediciones confiables y, como tal, se han empleado diferentes estrategias para enriquecer los parásitos en la etapa de anillo (p. ej., para ensayos de resistencia a medicamentos mediante gradientes de KCl-Percoll [3, 7]) o en la etapa de esquizonte (por ejemplo, para ensayos de invasión utilizando gradientes de Percoll [10] o enriquecimiento magnético [17, 18, 40]). En un ensayo de resistencia a medicamentos publicado anteriormente con P. vivax [3], se necesitaba un mínimo de 0,2% de parasitemia para mediciones de buena calidad, y el 72% del total de aislados cumplieron ese umbral antes de la congelación. Para caracterizar cualquier cambio en la parasitemia después de la descongelación y medir el efecto del enriquecimiento con KCl-Percoll, se midió la parasitemia antes de la congelación, después de la descongelación y después del enriquecimiento con KCl-Percoll de 47 aislados (Fig. 2C). Se observó una diferencia estadísticamente significativa en el porcentaje de parasitemia entre las tres condiciones (P = 0,0011 (F (1,034, 47,57) = 11,85) mediante ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples de Tukey). Hubo una recuperación promedio de la parasitemia del 74,7 % (rango de 7,21 a 419,36 %) entre el período previo a la congelación y el período posterior a la descongelación y un enriquecimiento promedio de 6,7 veces (rango de 0,13 a 39,0 veces) de la parasitemia después de KCl-Percoll (Fig. 2D). . Además, la proporción de aislamientos de parásitos que alcanzaron el umbral del 0,2 % disminuyó del 68 % antes de la congelación al 43 % después de la descongelación, pero posteriormente aumentó al 79 % después de KCl-Percoll (Fig. 2C, gráficos circulares inferiores), lo que demuestra la utilidad de este Método para aumentar la parasitemia. El porcentaje de recuperación de parásitos durante el enriquecimiento con KCl-Percoll también se estimó midiendo tanto el porcentaje de parasitemia mediante microscopía en portaobjetos como el número total de glóbulos rojos mediante recuentos de hemocitómetro tanto después de la descongelación como después de KCl-Percoll (Fig. 2E). La recuperación promedio fue del 22 % (rango 0,43 – 116,8 %), lo que sugiere que no todos los parásitos se enriquecen mediante este enfoque.

Si bien no existe un sistema de cultivo a largo plazo para P. vivax, se ha informado sobre la maduración ex vivo de parásitos a corto plazo [3, 6, 7, 10, 40]. Para establecer la capacidad de madurar de los aislados del biobanco, se seleccionaron un total de veinte aislados para experimentos de validación. Las muestras se descongelaron y enriquecieron en gradientes de KCl-Percoll y la estadificación y la parasitemia se midieron después del enriquecimiento y a las 24 h y 48 h en cultivo a corto plazo (Fig. 3A). Durante el transcurso de estos experimentos, ocasionalmente los portaobjetos resultaron ilegibles o dañados, y estos aislados se excluyeron del análisis en el momento dado. Durante las primeras 24 h, la parasitemia promedio se mantuvo relativamente constante, y algunos aislados mostraron disminuciones; sin embargo, a las 48 h hubo una disminución promedio del 64,9% en el porcentaje de parasitemia en todas las muestras. La maduración de los parásitos se cuantificó determinando el número de aislados con diferentes proporciones (< 20%, 20-50%, > 50%) de parásitos inmaduros (anillos tempranos y tardíos) o de parásitos en maduración (trofozoítos, esquizontes y gametocitos). (Figura 3B). Después del enriquecimiento, todos los aislados tenían al menos un 20% de parásitos inmaduros. A las 24 h, el 57,9% (11/19) tenía > 20% de estadios maduros y un subconjunto del 26,3% (5/19) tenía > 50% de estadios maduros. Estas proporciones no cambiaron apreciablemente ya que a las 48 h, el 60 % de los aislados (12/20) tenían > 20 % de estadios maduros y el 30 % (6/20) tenía > 50 % de estadios maduros.

Maduración de parásitos en cultivo ex vivo de corta duración. A Estadificación y parasitemia de 20 muestras de biobanco posteriores al enriquecimiento, 24 h y 48 h en cultivo a corto plazo. B Gráficos circulares que muestran la proporción de parásitos en estadios de anillo (anillos tempranos y tardíos) o en estadios tardíos (trofozoítos, esquizontes, gametocitos) entre aislados

Los parásitos maduros pueden enriquecerse fácilmente mediante la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) a través de las propiedades paramagnéticas de la hemozoína en la vacuola alimentaria del parásito [38], y es un método común para purificar parásitos para su uso en ensayos de invasión [17, 18, 40]. Después de al menos 40 h de cultivo a corto plazo, los parásitos se enriquecieron mediante MACS (Fig. 4A), con un promedio de 29,95% de parasitemia (rango 0,52-80,81%). Además, se determinó el número de parásitos por vial (Fig. 4B), con un promedio de 5,30 × 105/vial (rango 7,68 × 104–2,90 × 106/vial). Estos valores serían útiles cuando se utilizan parásitos para ensayos de invasión con el fin de determinar el número de pocillos de ensayo que se pueden configurar de manera útil por aislado.

Enriquecimiento de parásitos cultivados a corto plazo mediante MACS. Las muestras de parásitos se cultivaron a corto plazo durante al menos 40 h antes de MACS. A Distribución de parasitemias post-enriquecimiento de MACS. B Número calculado de parásitos/vial post-MACS. C % de recuperación calculado de parásitos después del enriquecimiento de MACS. Distribución de parasitemia D y número E de parásitos/viales de descongelaciones repetidas de aislados biobancados

La recuperación de parásitos mediante el enriquecimiento de MACS también se estimó midiendo el número de glóbulos rojos mediante hemocitómetro y el % de parasitemia mediante microscopía en portaobjetos antes y después de MACS. Para las 11 muestras que se analizaron, se observó un promedio de recuperación del 20,59 % (rango 5,94–51,44 %) (Fig. 4C). La reproducibilidad del enriquecimiento de MACS y la recuperación de parásitos también se determinó cuando se realizaron múltiples descongelaciones independientes del mismo aislado (Fig. 4D, E) y, en la mayoría de los casos, el % de parasitemia y el número de parásitos por vial variaron en menos del doble.

Además del método de criopreservación, la temperatura de almacenamiento y transporte que experimentan los aislados congelados puede afectar su viabilidad después de la descongelación. Estudios anteriores con P. falciparum han demostrado una viabilidad reducida de los parásitos criopreservados almacenados a -70 °C en comparación con las temperaturas del nitrógeno líquido [27, 30]. Por lo tanto, se realizó un experimento de variación de temperatura para imitar el transporte de muestras desde el sitio de recolección a otros lugares para uso experimental. Se criopreservaron nueve muestras utilizando la mezcla 2, generando cuatro viales, cada uno de los cuales se sometió a cuatro condiciones de almacenamiento de temperatura diferentes (Fig. 5A). El vial 1 (V1) fue la condición de control y se descongeló directamente del nitrógeno líquido en un período de 5 a 8 días. Los viales V2-V4 (condiciones de prueba) se transfirieron de nitrógeno líquido a -80 °C durante 7 días para imitar las condiciones de envío en hielo seco. El vial V2 se descongeló después de 7 días de almacenamiento a -80 °C, mientras que los viales V3 y V4 se devolvieron a nitrógeno líquido durante 7 días más para imitar posibles fluctuaciones de temperatura en un sitio donde las muestras se devolvieron a nitrógeno líquido para su almacenamiento. El vial V4 se cicló por segunda vez a -80 °C antes de descongelarlo, mientras que el vial V3 se descongeló del nitrógeno líquido a los 7 días.

Comparación de condiciones de congelación y almacenamiento. (A) Esquema de las condiciones de almacenamiento y congelación de parásitos probadas (V1-V4). Comparación de muestras Post descongelación (B), Post-KCl-Percoll (C), 24 h (D) y 48 h (E) con valores de parasitemia normalizados a V1. **P < 0,01 mediante análisis de efectos mixtos con comparaciones múltiples de Dunnett. Comparación de muestras almacenadas a largo plazo (7 a 10 años) en nitrógeno líquido o a -80 °C: (F) después de la descongelación y (G) a las 24 h en cultivo a corto plazo

Tras la descongelación, todas las muestras se enriquecieron con KCl-Percoll y se cultivaron a corto plazo con examen microscópico durante la descongelación, el enriquecimiento y después de 24 h y 48 h de crecimiento in vitro con datos normalizados a los valores V1 (Fig. 5B-E). No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre las condiciones post-descongelación y post-Percoll. Sin embargo, se observó una reducción significativa en la parasitemia para la condición V2 a las 24 h (P = 0,010 (F (1,399, 9,330) = 9,024) mediante análisis de efectos múltiples con comparaciones múltiples de Dunnett), aunque esta reducción no se observó a las 48 h. Además, para probar si podría haber efectos a largo plazo por el almacenamiento de parásitos a diferentes temperaturas, se comparó un conjunto de aislados cuyos viales se habían almacenado tanto en nitrógeno líquido como en temperaturas de -80 °C durante entre 7 y 10 años ( Fig. 5F, G) (tenga en cuenta que estas muestras se criopreservaron usando la mezcla 1). No se observaron diferencias estadísticamente significativas en la parasitemia ni después de la descongelación ni a las 24 h en cultivos a corto plazo, lo que sugiere que cualquiera de las temperaturas de almacenamiento es capaz de preservar el parásito.

El establecimiento de un biobanco de aislados criopreservados de P. vivax que puedan descongelarse de manera confiable para su uso posterior sería una herramienta poderosa para facilitar la investigación con este parásito. La actual falta de un sistema de cultivo para P. vivax impide el tipo de experimentos que se pueden realizar con otras especies de Plasmodium cultivables, como P. falciparum [43] y Plasmodium knowlesi [44,45,46]. Se han logrado avances en el recuento y estadificación de P. vivax que facilitarían la recolección de P. vivax para dicho recurso [3, 41]. Colección de aislados conservados y almacenados adecuadamente, combinados con la capacidad de enriquecer muestras con baja parasitemia con el uso de gradientes de KCl-Percoll para ensayos en etapa de anillo (p. ej., ensayos de resistencia a medicamentos) o de enriquecer parásitos maduros mediante gradientes de Percoll o MACS (p. ej., para ensayos de invasión), facilitaría los ensayos funcionales con este parásito poco estudiado. No sólo serían posibles más ensayos, sino que la generación de un biobanco con múltiples congelaciones del mismo donante permitiría realizar experimentos replicados, lo que generalmente no es posible cuando solo se pueden recolectar aislados vivos. Finalmente, el establecimiento de una fuente confiable de aislados criopreservados extiende la duración de la experimentación más allá de la típica temporada alta de transmisión, cuando se recolectan la mayoría de los aislados clínicos.

Para informar la generación de un biobanco criopreservado, se estudió la progresión y maduración de los estadios sanguíneos asexuales de P. vivax después de descongelar viales que habían sido criopreservados utilizando cuatro mezclas de criopreservación diferentes con diferentes proporciones de glicerolito 57 a glóbulos rojos (con o sin la inclusión de suero). A pesar de que la concentración final de glicerol varía (4,12 M (mezcla 1), 3,10 M (mezcla 2), 3,86 M (mezclas 3 y 4)) (archivo adicional 1: Tabla S1), las cuatro mezclas mostraron características ampliamente similares en términos de parasitemias post-descongelación, post enriquecimiento con KCl-Percoll y en cultivo ex vivo a corto plazo. Sin embargo, se eligió la mezcla 2 para generar un biobanco optimizado debido a una mayor recuperación y viabilidad de los parásitos en comparación con las otras mezclas.

De acuerdo con experimentos previos de optimización del cultivo a corto plazo [3], se observó una recuperación inferior al 100% de los parásitos después de la descongelación (Fig. 1C), así como la presencia de parásitos picnóticos y lisados ​​durante el cultivo in vitro (Fig. 3). lo que sugiere que pueden ser posibles mejoras adicionales en la metodología de criopreservación y descongelación, como comparar el método del sorbitol [39] para ver si hay una mejor recuperación de parásitos en comparación con el método de cloruro de sodio actualmente en uso [39]. Además, la medición de la lisis de los glóbulos rojos también puede ser informativa para comprender la eficacia de diferentes condiciones de criopreservación.

El uso de gradientes de densidad para enriquecer los reticulocitos se ha informado anteriormente, centrándose en los enfoques de Nycodenz [37], sistemas acuosos multifásicos [47] o Percoll [3, 40, 48]. Aquí se demostró la capacidad de los gradientes de densidad de KCl-Percoll para enriquecer los parásitos después de la descongelación hasta alcanzar parasitemias suficientemente altas para ensayos de resistencia a los medicamentos (> 0,2% de parasitemia [3]) (Fig. 1C). La recuperación medida de parásitos utilizando este método es todavía relativamente baja (Fig. 1E), lo que sugiere que pueden ser posibles otras mejoras en este enfoque. Los experimentos futuros también deberían medir directamente la recuperación de reticulocitos (tanto infectados como no infectados), así como la eficacia de la recuperación y maduración de las etapas sexuales [49], lo que puede ser útil para futuros estudios de transmisión.

La medición de la viabilidad y maduración de los parásitos durante el cultivo in vitro a corto plazo (Fig. 3) sugiere que al menos el 60% de los aislados en el biobanco serán capaces de alcanzar una maduración completa (con al menos un 20% de estadios maduros). Esto puede ser una subestimación, ya que es posible que los esquizontes en algunos aislados ya hayan madurado y hayan salido en el momento de 48 h en el que se realizaron las diapositivas. Una evaluación más precisa de la maduración puede requerir el uso de inhibidores de salida para bloquear la salida del parásito [50]. Además, las comparaciones futuras de la eficiencia del cultivo a corto plazo con aislados vivos también pueden ser informativas. El enriquecimiento en MACS de parásitos maduros (trofozoítos, esquizontes y gametocitos) mostró una distribución relativamente amplia en parasitemias, número de parásitos/vial y % de recuperación post MACS. La recuperación inferior al 100% puede deberse a la amplia distribución de las etapas del parásito observadas durante el cultivo ex vivo a corto plazo (Fig. 3). Además, el enriquecimiento de parásitos entre deshielos independientes mostró una reproducibilidad relativamente buena (Fig. 4D, E), lo que permite cierta capacidad para predecir la cantidad de parásitos maduros esperados de un deshielo individual, lo que sería clave en la planificación de ensayos de invasión [17, 40, 51].

Si bien se prefiere el almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido, se sabe poco sobre el efecto del ciclo entre temperaturas de almacenamiento de nitrógeno líquido y hielo seco/-80 °C sobre la viabilidad de Plasmodium spp. parásitos [27]. Cuando los aislados de parásitos se recolectan específicamente en entornos endémicos, las opciones disponibles para el almacenamiento de muestras durante el transporte desde el punto de recolección hasta el almacenamiento a largo plazo pueden ser limitadas. El almacenamiento a corto plazo de los aislados a diferentes regímenes de temperatura no mostró diferencias significativas en la viabilidad del parásito después de la descongelación y el enriquecimiento, mientras que una reducción de la parasitemia a las 24 h en cultivo a corto plazo para los parásitos que se habían almacenado a -80 °C se observó (Fig. 5D). Sin embargo, una comparación del almacenamiento a largo plazo de muestras en nitrógeno líquido y a -80 °C no reveló ninguna diferencia estadísticamente significativa entre el almacenamiento a cualquiera de las temperaturas, aunque es posible que la viabilidad varíe de una muestra a otra.

Se compararon cuatro métodos de criopreservación diferentes para P. vivax y un método proporcionó una mejor recuperación y maduración del parásito en cultivos in vitro a corto plazo. Utilizando este método, se estableció un biobanco de aislados clínicos con múltiples congelaciones por aislado y se validó mostrando la capacidad de enriquecer los parásitos después de la descongelación con gradientes de KCl-Percoll, y de que al menos el 60% de los parásitos maduren exitosamente en el corto plazo en cultivos in vitro. Finalmente, se probó el almacenamiento de parásitos criopreservados a diferentes temperaturas (almacenamiento en nitrógeno líquido y almacenamiento a -80 °C), pero al menos durante la duración de este estudio, no hubo evidencia de cambios en la viabilidad de los parásitos almacenados en nitrógeno líquido versus − Se encontraron 80 °C.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

glóbulo rojo

Clasificación de células activadas magnéticamente

Dimetilsulfóxido

Facultad de Medicina y Hospital de Goa

OMS. Informe mundial sobre la malaria 2022. Ginebra: Organización Mundial de la Salud; 2022.

Google Académico

Thomson-Luque R, Adams JH, Kocken CHM, Pasini EM. De lo marginal a lo esencial: el hilo dorado entre la detección de nutrientes, la composición del medio y la maduración de Plasmodium vivax en cultivo in vitro. Malar J. 2019;18:344.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Rangel GW, Clark MA, Kanjee U, Shaw-Saliba K, Lim C, Mascarenhas A, et al. Enriquecimiento y maduración intraeritrocítica ex vivo mejorados de Plasmodium vivax para ensayos de crecimiento de parásitos rápidos y sensibles. Agentes antimicrobianos quimioterápicos. 2018;62:e02519-e2617.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Russell B, Suwanarusk R, Malleret B, Costa FT, Snounou G, Kevin Baird J, et al. Estudios ex vivo en humanos sobre Plasmodium vivax asexual: el mejor camino a seguir. Int J Parasitol. 2012;42:1063–70.

Artículo PubMed Google Scholar

Borlon C, Russell B, Sriprawat K, Suwanarusk R, Erhart A, Renia L, et al. Los reticulocitos criopreservados de Plasmodium vivax y de sangre del cordón umbilical se pueden utilizar para invasión y cultivo a corto plazo. Int J Parasitol. 2012;42:155–60.

Artículo PubMed Google Scholar

Golenda CF, Li J, Rosenberg R. Propagación continua in vitro del parásito de la malaria Plasmodium vivax. Proc Natl Acad Sci Estados Unidos. 1997;94:6786–91.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kosaisavee V, Suwanarusk R, Nosten F, Kyle DE, Barrends M, Jones J, et al. Plasmodium vivax: ensayos isotópicos, PicoGreen y microscópicos para medir la sensibilidad a la cloroquina en aislados frescos y criopreservados. Exp Parasitol. 2006;114:34–9.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Cho JS, Russell B, Kosasaivee V, Zhang R, Colin Y, Bertrand O, et al. Determinación inequívoca de la invasión de reticulocitos por Plasmodium vivax mediante citometría de flujo. Int J Parasitol. 2016;46:31–9.

Artículo PubMed Google Scholar

Grimberg BT, Udomsangpetch R, Xainli J, McHenry A, Panichakul T, Sattabongkot J, et al. Invasión de Plasmodium vivax de eritrocitos humanos inhibida por anticuerpos dirigidos contra la proteína de unión a Duffy. PLoS Med. 2007;4:e337.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Russell B, Suwanarusk R, Borlon C, Costa FT, Chu CS, Rijken MJ, Sriprawat K, et al. Un ensayo confiable de invasión ex vivo de reticulocitos humanos por Plasmodium vivax. Sangre. 2011;118:e74-81.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Prajapati SK, Borlon C, Rovira-Vallbona E, Gruszczyk J, Menant S, Tham WH, et al. La disponibilidad del receptor 1 del complemento en la superficie de los glóbulos rojos modula la invasión de Plasmodium vivax a los reticulocitos humanos. Representante de ciencia ficción 2019;9:8943.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Rawlinson TA, Barber NM, Mohring F, Cho JS, Kosaisavee V, Gerard SF, et al. Base estructural para la inhibición de la invasión de Plasmodium vivax mediante un anticuerpo humano inducido por una vacuna ampliamente neutralizante. Microbiol natural. 2019;4:1497–507.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Urusova D, Carias L, Huang Y, Nicolete VC, Popovici J, Roesch C, et al. Base estructural para la neutralización de Plasmodium vivax mediante anticuerpos humanos adquiridos de forma natural que se dirigen a la DBP. Microbiol natural. 2019;4:1486–96.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Popovici J, Roesch C, Carias LL, Khim N, Kim S, Vantaux A, et al. La amplificación del gen que codifica la proteína de unión a Duffy permite a Plasmodium vivax evadir la inmunidad humoral anti-DBP del huésped. Comuna Nacional. 2020;11:953.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Malleret B, El Sahili A, Tay MZ, Carissimo G, Ong ASM, Novera W, et al. Plasmodium vivax se une al CD98hc (SLC3A2) del huésped para ingresar a los glóbulos rojos inmaduros. Microbiol natural. 2021;6:991–9.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

De Meulenaere K, Prajapati SK, Villasis E, Cuypers B, Kattenberg JH, Kasian B, et al. La invasión de Plasmodium vivax mediada por la banda 3 se asocia con variación transcripcional en los genes PvTRAg. Microbiol de infección de células frontales. 2022;12:1011692.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Scully EJ, Shabani E, Rangel GW, Gruring C, Kanjee U, Clark MA, et al. Generación de una línea celular progenitora eritroide inmortalizada a partir de sangre periférica: un sistema modelo para el análisis funcional de Plasmodium spp. invasión. Soy J Hematol. 2019;94:963–74.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gruszczyk J, Kanjee U, Chan LJ, Menant S, Malleret B, Lim NTY, et al. El receptor 1 de transferrina es un receptor específico de reticulocitos para Plasmodium vivax. Ciencia. 2018;359:48–55.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Matharoo-Ball B, Diop M, Kozlakidis Z. Armonización de los biobancos de muestra de COVID-19: barreras y oportunidades para estándares, mejores prácticas y redes. Salud Biosaf. 2022;4:280–2.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Betsou F, Parida SK, Guillerm M. Los biobancos de enfermedades infecciosas como catalizador hacia la medicina personalizada: paradigma de Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 2011;91:524–32.

Artículo PubMed Google Scholar

Ezzat S, Biga R, Kozlakidis Z. Biobancos en entornos de países de ingresos bajos y medianos para enfermedades infecciosas: desafíos y facilitadores. Salud Biosaf. 2022;4:290–2.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Echeverry DF, Nair S, Osorio L, Menon S, Murillo C, Anderson TJ. Persistencia a largo plazo de linajes clonales del parásito de la malaria Plasmodium falciparum en la región del Pacífico colombiano. Genética BMC. 2013;14:2.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Musasia FK, Nkumama IN, Frank R, Kipkemboi V, Schneider M, Mwai K, et al. La fagocitosis de los parásitos en etapa de anillo de Plasmodium falciparum predice la protección contra la malaria. Comuna Nacional. 2022;13:4098.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kimenyi KM, Wamae K, Ngoi JM, de Laurent ZR, Ndwiga L, Osoti V, et al. Mantenimiento de una alta diversidad genética temporal de Plasmodium falciparum y complejidad de la infección en infecciones asintomáticas y sintomáticas en Kilifi, Kenia, de 2007 a 2018. Malar J. 2022;21:192.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Coggeshall LT. Preservación de parásitos viables de la malaria en estado congelado. Proc Soc Exp Biol Med. 1939;42:499–501.

Artículo de Google Scholar

Jeffery GM. Preservación extendida a baja temperatura de los parásitos de la malaria humana. J Parasitol. 1957;43:488.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mutetwa SM, James ER. Conservación a baja temperatura de Plasmodium spp. Parasitología. 1985; 90 (parte 3): 589–603.

Artículo PubMed Google Scholar

Rowe AW, Eyster E, Kellner A. Preservación con nitrógeno líquido de glóbulos rojos para transfusión; un procedimiento de congelación rápida con bajo contenido de glicerol. Criobiología. 1968;5:119–28.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Diggs C, Joseph K, Flemmings B, Snodgrass R, Hines F. Síntesis de proteínas in vitro mediante Plasmodium falciparum criopreservado. Soy J Trop Med Hyg. 1975;24:760–3.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Christofinis GJ, Miller H. Un método simplificado para la criopreservación de Plasmodium falciparum a partir de cultivos continuos in vitro. Ann Trop Med Parasitol. 1983;77:123–6.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mathai E, Singh B. Un estudio comparativo de dos métodos para la criopreservación de Plasmodium falciparum. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1989;83:469–70.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Rossan RN. Criopreservación de los estadios sanguíneos de Plasmodium falciparum y Plasmodium vivax para estudios in vivo. Soy J Trop Med Hyg. 1985;34:207–8.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Noulin F, Borlon C, van den Eede P, Boel L, Verfaillie CM, D'Alessandro U, et al. Los reticulocitos criopreservados derivados de células madre hematopoyéticas pueden ser invadidos por aislados criopreservados de Plasmodium vivax. Más uno. 2012;7:e40798.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zeeman AM, der Wel AV, Kocken CH. Cultivo ex vivo de Plasmodium vivax y Plasmodium cynomolgi y cultivo in vitro de estadios sanguíneos de Plasmodium knowlesi. Métodos Mol Biol. 2013;923:35–49.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mehlotra RK, Blankenship D, Howes RE, Rakotomanga TA, Ramiranirina B, Ramboarina S, et al. Cultivo in vitro a largo plazo de aislados de Plasmodium vivax de Madagascar mantenidos en sangre de Saimiri boliviensis. Malar J. 2017;16:442.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

de Oliveira TC, Rodrigues PT, Menezes MJ, Goncalves-Lopes RM, Bastos MS, Lima NF, et al. Diversidad y diferenciación de todo el genoma en poblaciones del Nuevo Mundo del parásito de la malaria humana Plasmodium vivax. PLoS Negl Trop Dis. 2017;11:e0005824.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Roobsoong W, Tharinjaroen CS, Rachaphaew N, Chobson P, Schofield L, Cui L, et al. Mejora de las condiciones de cultivo para el cultivo in vitro a largo plazo de Plasmodium vivax. Malar J. 2015;14:297.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Trang DT, Huy NT, Kariu T, Tajima K, Kamei K. Concentración en un solo paso de glóbulos rojos infectados por el parásito de la malaria y eliminación de glóbulos blancos contaminantes. Malar J. 2004;3:7.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Moll K, Kaneko A, Scherf A, Wahlgren M. Métodos en la investigación de la malaria. Glasgow, Reino Unido y Manassas, VA, EE. UU.: Centro de recursos de reactivos de referencia e investigación de la malaria (MR4); 2013.

Kanjee U, Gruring C, Babar P, Meyers A, Dash R, Pereira L, et al. Las cepas de Plasmodium vivax utilizan vías alternativas de invasión. J Infectar Dis. 2021;223:1817–21.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lim C, Pereira L, Shardul P, Mascarenhas A, Maki J, Rixon J, et al. Método de recuento de microscopía óptica mejorado para contar con precisión la parasitemia y la reticulocitomia por Plasmodium. Soy J Hematol. 2016;91:852–5.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chery L, Maki JN, Mascarenhas A, Walke JT, Gawas P, Almeida A, et al. Perfiles demográficos y clínicos de pacientes con Plasmodium falciparum y Plasmodium vivax en un centro de atención terciaria en el suroeste de la India. Malar J. 2016;15:569.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Trager W, Jensen JB. Parásitos de la malaria humana en cultivo continuo. Ciencia. 1976;193:673–5.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kocken CH, Ozwara H, van der Wel A, Beetsma AL, Mwenda JM, Thomas AW. Plasmodium knowlesi proporciona un rápido sistema de transfección in vitro e in vivo que permite estudios de desactivación genética de doble cruce. Infectar inmune. 2002;70:655–60.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moon RW, Hall J, Rangkuti F, Ho YS, Almond N, Mitchell GH, et al. Adaptación del patógeno de la malaria genéticamente tratable Plasmodium knowlesi al cultivo continuo en eritrocitos humanos. Proc Natl Acad Sci Estados Unidos. 2013;110:531–6.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lim C, Hansen E, DeSimone TM, Moreno Y, Junker K, Bei A, et al. La expansión del nicho celular del huésped puede impulsar la adaptación de un parásito zoonótico de la malaria a los humanos. Comuna Nacional. 2013;4:1638.

Artículo PubMed Google Scholar

Kumar AA, Lim C, Moreno Y, Mace CR, Syed A, Van Tyne D, et al. Enriquecimiento de reticulocitos de sangre total mediante sistemas acuosos de polímeros multifásicos. Soy J Hematol. 2015;90:31–6.

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Clark MA, Kanjee U, Rangel GW, Chery L, Mascarenhas A, Gomes E, et al. La infección por Plasmodium vivax compromete la estabilidad de los reticulocitos. Comuna Nacional. 2021;12:1629.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shaw-Saliba K, Clarke D, Santos JM, Menezes MJ, Lim C, Mascarenhas A, et al. Infección de colonias de laboratorio de mosquitos Anopheles con Plasmodium vivax a partir de aislados clínicos criopreservados. Int J Parasitol. 2016;46:679–83.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Ressurreicao M, Thomas JA, Nofal SD, Flueck C, Moon RW, Baker DA, et al. Uso de un inhibidor de quinasa altamente específico para una sincronización rápida, simple y precisa de Plasmodium falciparum y Plasmodium knowlesi parásitos en etapa sanguínea asexual. Más uno. 2020;15:e0235798.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rangel GW, Clark MA, Kanjee U, Goldberg JM, MacInnis B, José Menezes M, et al. Perfil transcripcional de Plasmodium vivax de aislados criopreservados de bajo aporte a lo largo del ciclo de desarrollo intraeritrocítico. PLoS Negl Trop Dis. 2020;14:e0008104.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

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La financiación para este trabajo fue proporcionada por la subvención de los Institutos Nacionales de Salud (NIH 5U19AI089688-13 a PKR).

Facultad de Medicina y Hospital de Goa, Bambolim, Goa, 403202, India

Rashmi Dash, Ligia Pereira, Anjali Mascarenhas, Jayashri Walke, Anvily Almeida, Mezia Fernandes, Edwin Gomes y Anar Khandeparkar

Departamentos de Química y Salud Global, Universidad de Washington, Seattle, WA, 98195, EE. UU.

Rashmi Dash, Ligia Pereira, Anjali Mascarenhas, Jayashri Walke, Mezia Fernandes, John White, Laura Chery-Karschney y Pradipsinh K. Rathod

Departamento de Inmunología y Enfermedades Infecciosas, Escuela de Salud Pública TH Chan de Harvard, Boston, MA, 02115, EE. UU.

Kristen M. Skillman, Sheena Dass, Anvily Almeida, Manoj T. Duraisingh y Usheer Kanjee

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RD, LP, AM, JW, AA, MF, UK, SD recolectaron muestras y generaron datos. RD, KMS y UK analizaron los datos y escribieron el manuscrito. EG, JW, LCK, PKR, UK, KMS, RD, AK, SD y MDT interpretaron y revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Usheer Kanjee.

El protocolo de sujetos humanos y los formularios de consentimiento para inscribir a pacientes infectados por Plasmodium en este estudio en Goa Medical College and Hospital (GMC), por las Juntas de Revisión Institucional de la División de Microbiología y Enfermedades Infecciosas (DMID) del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades de EE. UU. Enfermedades Infecciosas (aprobación DMID 11-0074), la Universidad de Washington (aprobación 42271/1192), así como Goa Medical College Hospital, Bambolim, Goa, India.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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. Resumen de Plasmodium spp. métodos de criopreservación.

. Datos para las figuras 1 a 5.

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Reimpresiones y permisos

Dash, R., Skillman, KM, Pereira, L. et al. Desarrollo de un biobanco de Plasmodium vivax para ensayos funcionales ex vivo. Malar J 22, 250 (2023). https://doi.org/10.1186/s12936-023-04668-2

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Recibido: 17 de marzo de 2023

Aceptado: 07 de agosto de 2023

Publicado: 31 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12936-023-04668-2

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